Bu protokol, hücre içinde aktif RhoC GTPaz düzeylerini belirlemek için tahlil aşağı çekme kullanır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Bu makalede
Özet
Özet
RhoC GTPaz RhoA GTPaz% 91 homoloji vardır. Çünkü hücreleri yaygınlığı, RhoA GTPaz için birçok reaktifler ve teknikleri geliştirilmiştir. Ancak, RhoC GTPaz nispeten düşük seviyelerde metastatik kanser hücrelerinin ifade edilir. Bu nedenle, birkaç RhoC özel reaktifler geliştirilmiştir. Biz RhoC GTPaz tespit etmek için bir Rho aktivasyon tahlil adapte var. Bu teknik aktif RhoC GTPaz çekin bir GST-Rho bağlayıcı etki alanı füzyon proteini kullanır. Buna ek olarak, toplam düzeyleri (GTP ve GSYİH bağlı) RhoC GTPaz belirlemek için testin başında total protein hasat. Bu hücre aktif karşı toplam RhoC GTPaz belirlenmesi için sağlar. Ancak, bu prosedürün birçok ticari sürümleri geliştirilmiştir, ticari kitleri RhoA GTPaz için optimize edilmiştir ve genellikle RhoC GTPaz için iyi bir sonuç vermez. Testinin parçaları RhoC-spesifik antikor gelişimi yanı sıra modifiye edilmiştir.
Protokol
1. Hazırlayın ve GST-füzyon protein
- BamH1/EcoR1 pGEX3x vektör içine subcloned rhotekin Rho bağlayıcı etki alanı (RBD) ilk 90 N-terminal amino asitleri içeren JM109 yetkili bakterilerin Gliserol stokları yapılır.
Yüksek verim sağlamak için aşağıdaki adımları, her bir deney için yapılmalıdır. Deneyimlerimize göre, taze GST-RBD sağlam ve doğru bir GTPaz aktivasyon tahlil için anahtar hazırlanmıştır. - Gliserol stokunun LB amp 50 ml (yaklaşık, Çözülme yok) 50 mcL ekleyin ve titreme ile 37 ° C gecede büyümek.
- 500 ml LB-amp 01:10 seyreltilir ve 1 saat boyunca büyümek
- 2 saat için 0.1 mM IPTG GST-protein üretimini uyarır. ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Prosedürün en kritik adım, taze GST-RBD nesil. Bu adımı yakın ilgi ödenmemesi başarısızlığın ana nedeni budur. GST-RBD (1.2) üretimi hücre lizatı (2.5) ile gecelik inkübasyon tüm adımları tek bir gün içinde yapılmalıdır. Bir diğer önemli adım, hücre lizatları üretmek için yeterli hücre vardır emin olun. RhoC GTPaz, hücre düşük seviyelerde bulunan olma eğilimindedir bakarken özel bir önem taşımaktadır.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Savunma Bölümü W81XWH-05-1-0005, W81XWH-06-1-0495, W81XWH-08-1-0029 ve W81XWH-08-1-0356
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Glutatyon-sefaroz 4B boncukları | GE Healthcare | 17-0756-01 | |
| Criterion %4-20 Tris-HCl jelleri | Bio-Rad | 345-0032 |
Kaynaklar
- van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L. W., Merajver, S. D. RhoC GTPase, a novel transforming oncogene for human mammary epithelial cells that partially recapitulates the inflammatory breast cancer phenotype. Cancer Res. 60 (20), 5832-5838 (2000).
- van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L., Merajver, S. D.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
