Yöntem makalesi

Su Sistemleri Virüs Üretim Oranlar tahmin

DOI:

10.3791/2196

⸱

22 Eylül 2010

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, University of Tennessee

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deniz ve tatlı su sistemlerinin virüslerin ciro oranı bir azalma ve yeniden oluşmaları tekniği ile tahmin edilebilir. Veriler araştırmacılar, su sistemlerinde virüs aracılı mikrobiyal ölüm oranları anlaması için izin verir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Virüsler, deniz ve tatlı su sistemlerinin yaygın bileşenleri ve mikrobiyal ölüm önemli ajanları olduğu bilinmektedir. Sonra mikrobiyal toplum yapısı ve işlevi daha iyi modelleri geliştirmek gibi virüsler sucul biyojeokimyasal döngülerini değiştirmeye nasıl çalıştığını anlayışımızı ilerletmek gibi bu sürecin niceliksel tahminler geliştirilmesi kritik öneme sahiptir. Virüs azaltma tekniği araştırmacıları virüs parçacıkları endemik mikrobiyal topluluk yayımlanan hızını tahmin etmek sağlar. Mikrobiyal topluluk yakın bir ortam konsantrasyon korunurken Kısacası, ücretsiz (ekstraselüler) virüslerin bolluğu bir örnek azalır. Mikrobiyal topluluk, daha sonra ücretsiz virüs olmaması ve virüsler kantitatif (topluluk zaten bulaşmış üyelerinin lizis yoluyla) örnek reoccur Epifloresans mikroskobu ile belirlenebilir veya belirli virüslere durumda, hangi oranı inkübe PCR. Bu oranlar daha sonra virüs aracılı hücre erimesi nedeniyle mikrobiyal ölüm oranını tahmin etmek için kullanılabilir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. "Virüs-free" Su (Wilhelm & Poorvin 2001) oluşturun için Deniz Suyu Ultrafiltrasyon

  1. Deniz suyu / lakewater yaklaşık 20L mümkün olduğunca aseptik toplanır.
  2. Su, 142 mm çaplı polikarbonat seri ile toplum analizi için -20 ° C'de muhafaza edilebilir 0,8 mikron filtre prefiltered. Daha büyük gözenek boyutu filtreleri, çok verimli sistemler için bu adımı önce kullanılıyor olabilir.
  3. 30 kDa kesme spiral kartuşu tüm virüsleri dışlamak için kullanılan bir Amicon M12 sistemi (Millipore), hatta küçük RNA virüsleri Ultra filtre su elde etmek için.
  4. Yaklaşık 15-16 kPa backpressure örnekleri ile işlenmiş ve ~% 25 hızda yoğunlaşmıştır.
  5. ~ 500 ml su kalan örnek virüs serbest su, geri kalan 19.5 L viral üretim deneyleri için kullanılan olacak konsantre bir virüs topluluk (diğer deneyler için kaydedilebilir) içerecektir.
  6. Amicon M12 sistemi kullanımı her gün sonra, membran filtre kartuşunun zarar görmesini önlemek için temizlenmesi gerekir.
  7. Deniz suyu ile çalışıyorsanız, 30-45 dakika için 0,1 N NaOH çözeltisi ile yıkanması takip Milli-Q su en az 6L membran yıkayın.
  8. Yine kartuşu en az 6L Milli-Q su ile durulayın.
  9. M12 sistemini kullanarak bittiğinde, spiral kartuşu, 4 0.05MH 3 PO 4 çözüm ° C saklanmalıdır

2. Viral Üretim Yöntemi Virüs Azaltma (Wilhelm ve ark 2002)

  1. Hem de ev sahibi ve virüsler, 0.2 mikron nominal gözenek boyutu düşük protein bağlayıcı filtresi (örneğin, Durapore) üzerine yerleştirilir. Ile elde edilen ve bir sterifilter ünitede yerleştirilir deniz suyu / lakewater örnek 500 ml
  2. Sürekli olarak, filtre üzerinde yoğunlaşarak bakteri hücrelerinin inhibe etmek için, steril bir transfer pipet kullanarak örnek resuspending örnek hafifçe <200 mmHg basınçlı vakum.
  3. Yavaş yavaş ultrafiltratında üç ciltlik önemli ölçüde örnek ücretsiz virüs sayısını azaltmak için bakteriyel süspansiyona eklenir.
  4. Bakteriyel fraksiyonu virüs ücretsiz su ile 500 mL geri seyreltilir ve her biri 150 ml olmak üzere üçe ayrılır çoğaltır ve açık 250ml polikarbonat şişe konur.

3. Viral Üretimi için Teğetsel Akış Filtrasyon (TFF) Yöntemi (Weinbauer ve ark 2002, Winget ve ark 2005)

TFF viral azaltma yöntemine alternatif bir yaklaşımı temsil ediyor.

  1. Yukarıda açıklandığı gibi, yaklaşık 500 ml doğal örnek toplanır.
  2. Bu örnek, gözenek boyutu 0.2 mikron nominal teğetsel akış filtrasyon sistemi kullanarak yoğunlaşmıştır.
  3. Yaklaşık 10-15 ml bakteri fraksiyon azalır, Ultra filtre, virüs serbest su eklenir ve yukarıdaki gibi dağıtılır.
  4. Çoğaltmak şişe çevre odaları kullanılarak yerinde koşullarda inkübe edilir.
    1. Işık seviyeleri net tarama ile mavi renkli akrilik veya şeffaf akrilik kullanarak ışık yoğunluğunu azaltmak için yüzey koşulları değişmiş.
    2. Ortam yüzey sıcaklıkları genellikle akan deniz suyu güverte inkübatör ile elde edilir.
  5. Cryovials ilave% 2,0-2,5 steril glutaraldehid son bir konsantrasyon ile 0 zamanında bakteriyel ve viral bolluk tahminleri için numuneler alınır. Bu örnekler hemen sıvı nitrojen ile dondurulur flaş ve işlenmiş kadar dondurularak saklanmalıdır.
    1. Sıvı azot mevcut değilse, mikroskopi slaytlar (aşağıdaki yordama bakın) hazırlanan ve hemen işleme olabilir
  6. Alınan örnekler, yukarıda anlatılan yöntemi ile en az 10 saat boyunca her 2.5 saatte toplanır.
    1. Bu zaman su kantitatif PCR analizi için toplanan olabilir. 5 ml numune sıvı nitrojen içinde acil flaş dondurma hiçbir sabitleştirici ajan cryovial eklenebilir.

4. Viral Üretim Mikroskobu (Noble ve Fuhrman 1998 Wen ve ark 2004)

  1. 0.02-mikron mikroskopi için filtre uygulanmasını Donmuş numuneler buz üzerinde çözdürülmelidir.
  2. SYBR Green, steril su ile stok solüsyonu 01:10 seyreltilmesi ile bir stok solüsyonu hazırlayın. Sonra, stok solüsyonu, stok solüsyonu 1 ml, 39 ml steril su ekleyerek çalışan bir solüsyon hazırlanır. % 50 gliserol,% 50 fosfat serum fizyolojik tamponlu (PBS, 0.05 M Na 2 HPO 4,% 0.85 NaCl, pH 7.5) ve% 2.5 p-fenilendiamin taze stok solüsyonu başlamadan önce hazırlanmalıdır. 4% 50% glycerol/50 PBS çözüm tutun ° C ve P-phenylenediamine stok -20 ° C başlangıç ​​kadar karanlıkta. Sağ filtreleme önce Antifade çözüm olarak kullanılmak üzere bir final konsantrasyon% 0.1% 50% glycerol/50 PBS p-fenilendiamin ekleyin.
  3. 25 mm 0.45 mikron MicronStep, selülozik destek filtre üst 0.02 mikron Anodisc filtre koyun. Tamamen kurutulmuş kadar 20 pKa Anodisc ve vakum üst sabit numune 850 mcL ekleyin. 100 steril bir Petri kabı SYBR Green çalışma çözüm mcL ve hala vakum, SYBR Green filtre kulesi ve yerden dikkatlice Anodisc kaldırmak. Örnekleri 20 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe edin. Dikkatle SYBR Green çözüm filtreyi kaldırmak ve tüm kalan boya kaldırmak için bir filtre ile Kimwipe arka fitil. İsterseniz, kule filtre dönmek ve aşırı leke durulayın filtre ile 0.02 mikron süzülmüş su veya steril ortam 800 mcL kadar geçmek.
  4. Bir mikroskop lamı antifade çözüm küçük bir damla ekleyin ve üstüne bir kapak kayma yerleştirin. Kapak kayma çıkarın ve mikroskop lamı antifade çözüm ıslak kuru filtre ekleyin. Yine kapak kayma antifade çözüm küçük bir miktar ekleyin ve yavaş yavaş bu formun herhangi bir kabarcıkları kurtulmak için emin olun, filtrenin üstüne yerleştirin.
  5. Gereken (bu solmaya önlemek için bir kaç ay içinde kullanılır ve virüs sayıları indirdi olmalıdır) kadar -20 ° C'de hemen slaytlar dondurmak
  6. Virüsler, geniş bir mavi filtre seti (λ Ex = 450 - 490 nm, λ Em = λ bir bastırma filtresi 510 nm = 510 nm) ile (bizim durumumuzda bir Leica DMRXA mikroskop) floresan mikroskopi kullanılarak numaralandırılır. Her filtre, filtre zarından virüs bile dağılımını sağlamak için her alanda ızgara toplam virüsleri ölçmek için emin olun, en az 20 alan sayılır görünümü olacak.
  7. Üç bağımsız virüs tekrarını ortalama oranları hesaplanır ve standart sapma üretim oranları belirlenir çoğaltır.

5. Temsilcisi Sonuçlar

Araştırmacı tarafından toplanan ham veri virüs bolluk tekrarını oranları üretmek için minimal matematiksel işleme gerektirir. Bu çalışmada kaynaklanan birincil veri seti inkubasyon alınan örnekler virüs bolluk tekrarını oranları. Bu sonuçlar, örneklerin her biri için virüs bolluğu vs zaman bağımsız regresyonlar oluşturur. Her bir numune için ayrı ayrı inkubasyon araştırmacı oranlarının yanı sıra bir varyasyon tahmini (örneğin, standart sapma) (bkz. Şekil 1). Hesaplayabilirsiniz üç çoğaltmak-inkubasyon tamamlayarak, bu yüzden bir tedavi olarak hareket

Bu sürecin bir ihtar virüs bolluk değişmez bir azalma örnek virüs yükünü taşıyan ana hücrelerinde azalmaya yol açar. Kaynak (filtrelenmemiş deniz suyu veya göl suyu) ve T = 0 inkübasyon örnek, bakteri bolluk sayımı bu kayıp telafi etmek gereklidir. Bu bilgiler, kayıp hücrelerinin yüzdesini hesap kullanılır: virüs bolluk azaltma süreci için ya da herhangi bir mikrobiyal topluluğun üyelerine karşı seçici olduğunu varsayarak, bu faktör daha sonra virüs yerinde üretim hızı tahmin etmek için kullanılır. .

Şekil 1
Şekil 1. Epifloresans mikroskopi kullanılarak in situ koşullarda 10 saat inkübasyon üzerinde parçacıklar gibi virüs Örnekleri üretimi 2008 yılı Eylül ayında Yeni Zelanda'nın kıyılarında çiçek fitoplankton sırasında toplanmıştır.

Şekil 2
Şekil 2. Assaying virüs üretim için iş akış sürecinin şematik diyagramı. Virüssüz su üretmek için numune su ultrafiltrasyon süreci başlar. Bu bir ultrafiltrasyon sistemi kullanılarak tamamlandı. Paralel su örneklerinde mikrobiyal topluluğun (enfekte ve enfekte olmayan hücrelere bir karışımını içeren) muhafaza ederken, bir filtre ile geçti aynı sitede ve serbest virüslerle toplanır. Bu topluluk daha sonra virüs ücretsiz su ile yeniden süspanse ve yerinde koşulları altında inkübe edilir . Virüs tekrarını oranı, önümüzdeki 10 saat sonra virüs üretim oranlarını belirlemek için izlenmektedir.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Virüsler deniz mikrobiyal topluluklar nasıl etkilediğini anlamada önemli bir bileşeni virüs parçacık üretilmektedir hızını belirlemek için. Bollukları çoğu sistemlerde statik (Wilhelm & Suttle 1999, Weinbauer 2004) (daha fazla veya daha az) ve sucul sistemlerde bu virüsler hızla kaldırıldı veya non-enfeksiyöz işlenen göz önüne alındığında (Wilhelm ve ark 1998), daha sonra üretim oranları olmalıdır görece hızlı bir kayıp parçacıkları yerine.

Mikrobiyal topluluğun neden ölüm virüsleri tahmin, bir virüs, bir hücreye ("patlama boyutu") lyses her zaman birçok virüs nasıl üretildiği bir bilgi gerektirir. Doğal örneklerinde Virüs patlama boyutları büyük ölçüde değişebilir. Burst boyutları doğrudan transmisyon elektron mikroskobu (örneğin, Weinbauer & Peduzzi 1994) tarafından belirlenen, ancak bu her zaman pratik değil, belirli bir laboratuvar kapasitesinin ötesindeki sık sık ya da olabilir. Ampirik olarak tespit edilemediği durumlarda, parçalayıcı olay başına 24 virüs edebiyat değerleri, tatlı su sistemleri için deniz sistemleri ve 34 için kullanılan (Parada ve ark 2006 ). Bu sayıya bölündüğü virüs üretim oranı ise, sonuç, günlük bazda virüsler tarafından tahrip hacim başına hücre bolluğu. Sonra, söz konusu sistem için virüs kaynaklı ölüm ile sonuçlanan bakteriyel bolluk ayakta stok değeri parçalanmış mikropların ayrılabilir: mevcut tahminleri aralığı az yüzde neredeyse tüm nüfusu ve sık sık söz konusu sistem diğer faktörlere bağlıdır. (Wilhelm & Matteson 2008). Toplam mortalite yüzdesi belirlemek için bu sayı genellikle iki (% 50 hücrelerin yeniden gidin ve hücrelerin% 50, Weinbauer 2004 kayıp olduğunu varsayım çalışan) ile çarpılır.

Haline gelmiştir besin ve iz element biyoyararlanım (örneğin, N, P, Fe) birincil üretkenlik oranı sınırı, ve karbon akı olarak, sucul sistemleri aracılığıyla, ve bu süreç içinde, virüs kaynaklı mikrobiyal ölüm rolü anlaşılması için verilen deniz jeokimyacılar ilgi. Çeşitli tahminlere şimdi (2009 2008, Higgins ve ark. Rowe ve ark) virüsler günlük bazda önemli bir besin elementi konsantrasyonları serbest su sütunu geri öneririz var ve bu unsurların hızla mikrobiyal toplum tarafından asimile (Poorvin et diğerleri, 2004, Mioni ve ark 2005). Miktarda besin hücre başına (başlar "kotaları) tarafından tahrip hücrelerinin sayısı çarpılarak ortamda besin akı oranı tespit edilebilir. Bu bilgiler, mikrobiyal gıda ağları su sistemleri arasında nasıl işlediğini anlamak için kritik bir bileşen sağlayabilir.

Devam eden gelişmeler: Şimdiki çabalar, bir dizi araştırma grupları gibi belirli organizmaların virüs aktivitesi tarafından nasıl etkilendiğini belirlemek için, toplum içinde belirli virüsleri numaralandırılamadı Yukarıda ifade edilen stratejinin uyarlanması ve içerir. Bunu yapmak için araştırmacılar, toplam virüs toplumun tahminlerine paralel olarak belirli virüslere gruplar veya aileler bolluğu tahmin etmek için kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) kullanın. Sonuçlar daha sonra doğrudan belirli plankton gruplar için virüs ölüm, besin ciro, vb tahminleri sağlamak için uygulanır. Bu yeni ve güçlü bir yaklaşım, önümüzdeki yıllarda araştırmacılar, virüslerin ekoloji ile ilgili süreçlere çok daha derin kazmak ve ilk kez, laboratuar sistemleri kısıtlamaları ötesinde belirli virüs host toplulukların etkileşimi ölçmek için izin verecektir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalenin yayın Tennessee Üniversitesi Araştırma Dairesi bir hibe ile desteklenmiştir. Yazarlar, öğrenciler ve araştırmacılar, bu işlemler rafine için çalıştılar, önceki nesil teşekkür ederim. Araştırma, Ulusal Bilim Vakfı (NSF-0.851.113, NSF 0.825.405 ve NSF 0.550.485) hibe tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2.5% p-fenilendiaminAcros Organics130575000Sönümleme (Antifade) stoğu
Amicon Proflux M12 sistemiEMD MilliporeN/ABu adım için herhangi bir ultrafiltrasyon cihazı kullanılabilir
SYBR Green I nükleik asit jel boyasıInvitrogenS-7563
Helicon S10 30kDa FiltreEMD MilliporeCDUF010LT
Pelicon XL filtreler 0.22 μmFisher ScientificPXGVPPC50
GE 0.2 μm PCTE membran filtreler (47mm)Fisher Scientific09-732-35
Millipore Labscale Tanjansiyel Akış Filtrasyon SistemiEMD MilliporeXX42LSS11Bu adım için diğer TFF sistemleri kullanılabilir
0.45 μm Micronstep, Selülozik, beyaz düz filtreler (25mm)Fisher ScientificE04WP02500
GE Whatman 0.02 μm Anodisc filtreler (25mm)Fisher Scientific68-09-6002
Leica DMRXA mikroskobuMavi filtre setine sahip herhangi bir epifloresan mikroskop kullanılabilir
20L polikarbonat damacanalarFisher Scientific
GliserolFisher ScientificBP229-4
PBS (0.05 M Na2HPO4, 0.85% NaCl, pH 7.5)Fisher ScientificBP329-500, S640-500
%50 Glutaraldehit Fisher ScientificG151-1
Corning 2 mL Kriyotüpler-Dış Dişli polipropilenFisher Scientific09-761-71Herhangi bir kriyotüp kullanılabilir
Corning 5 mL Kriyotüpler-Dış Dişli polipropilenFisher Scientific09-761-74Herhangi bir kriyotüp kullanılabilir
%85 H3PO4Fisher ScientificA242-212Sarmal Membran saklama
NaOH peletleriFisher ScientificS318-3M12 temizliği
Dereceli Silindirler
Isopore 0.8-μm gözenek boyutlu membran filtre (142mm)EMD MilliporeATTP14250
Millipore Paslanmaz Çelik Basınçlı Filtre Tutucu (142mm)Fisher ScientificYY30 090 00

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Higgins, J. L., Kudo, I., Nishioka, J., Tsuda, A., Wilhelm, S. W. The response of the virus community to a mesoscale iron fertilization in the sub-Arctic Pacific Ocean. Deep-Sea Res II. 56, 2788-2795 (2009).
  2. Mioni, C. E., Poorvin, L., Wilhelm, S. W. Virus and siderophore-mediated transfer of available Fe between heterotrophic bacteria: characterization using a Fe-specific bioreporter. Aquat Microb Ecol. 41, 233-245 (2005).
  3. Noble, R. T., Fuhrman, J. A. Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria. Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).
  4. Parada, V., Herndl, G., Weinbauer, M. G. Viral burst size of heterotrophic prokaryotes in aquatic systems. J Mar Biol Assoc U K. 86, 613-621 (2006).
  5. Poorvin, L., Rinta-Kanto, J. M., Hutchins, D. A., Wilhelm, S. W. Viral release of Fe and its bioavailability to marine plankton. Limnol Oceanogr. 49, 1734-1741 Forthcoming.
  6. Rowe, J. M., Saxton, M. A., Cottrell, M. T., DeBruyn, J. M., Berg, G. M., Kirchman, D. L., Hutchins, D. A., Wilhelm, S. W. Constraints on virus production in the Sargasso Sea and North Atlantic. Aquat Microb Ecol. 52, 233-244 (2008).
  7. Weinbauer, M. G. Ecology of prokaryotic viruses. FEMS Microbiol Rev. 28, 127-181 (2004).
  8. Weinbauer, M. G., Peduzzi, P. Frequency, size and distribution of bacteriophages in different marine morphotypes. Mar Ecol Prog Ser. 108, 11-20 (1994).
  9. Weinbauer, M. G., Winter, C., Hö, fle, G, M. Reconsidering transmission electron microscopy based estimates of viral infection of bacterioplankton using conversion factors derived from natural communities. Aquat Microb Ecol. 27, 103-110 (2002).
  10. Wen, K., Ortmann, A. C., Suttle, C. A. Accurate estimation of viral abundance by epifluorescence microscopy. Appl Environ Microbiol. 70, 3862-3867 (2004).
  11. Wilhelm, S. W., Brigden, S. M., Suttle, C. A. A dilution technique for the direct measurement of viral production: a comparison in stratified and tidally mixed coastal waters. Microb Ecol. 43, 168-173 (2002).
  12. Wilhelm, S. W., Matteson, A. R. Freshwater and marine virioplankton: a brief overview of commonalities and differences. Freshw Biol. 53, 1076-1089 (2008).
  13. Wilhelm, S. W., Poorvin, L. Quantification of algal viruses in marine samples. Paul, J. H. , Academic Press. London, UK. 53-66 (2001).
  14. Wilhelm, S. W., Suttle, C. A. Viruses and nutrient cycles in the sea. Bioscience. 49, 781-788 (1999).
  15. Wilhelm, S. W., Weinbauer, M. G., Suttle, C. A., Jeffrey, W. H. The role of sunlight in the removal and repair of viruses in the sea. Limnol Oceanogr. 43, 586-592 (1998).
  16. Winget, D. M., Williamson, K. E., Helton, R. R., Wommack, K. E. Tangential flow diafiltration: an improved technique for estimation of virioplankton production. Aquat Microb Ecol. 41, 221-232 (2005).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Vir s Azaltma Tekni iEpifloresan MikroskopiKantitatif PCRMikrobiyal MortaliteVir s Say mUltrafiltrasyonVir s TekrarlamasVir s Lizisi

İlgili makaleler