Mitokondri Yüksek Coupled Sıçan Kalp hazırlanması

Özet

Biz а hücresel biyoenerjetik, biyofiziksel ölçümleri, proteomik veya mitokondriyal DNA ve lipidler analizi fonksiyonel veya yapısal çalışmalar mitokondri saf, çok birleştiğinde sıçan kalp izolasyonu için protokol açıklar.

Özet

Oksidatif fosforilasyon sürecinde hücresel ATP nesil mitokondri fonksiyonu yaygın olarak kabul edilmektedir. Geçtiğimiz yıllarda enerji üretimi daha mitokondri diğer fonksiyonları anlayışımızda önemli gelişmeler olmuştur. Bunlar, organelleri, memeli geliştirme sinyalizasyon ve hücre metabolizması ve hücre çoğalması arasındaki koordinasyonu katkıları yanı sıra yaşlanma gibi davranan, apoptozis rollerini içerir. Mitokondri tarafından modüle biyolojik süreçlerin anlayışımız sağlam dokulardan laboratuvar hayvanları mitokondri izolasyon ve taşıma için sağlam bir yöntem dayanmaktadır. Sıçan kalp Mitokondri knock-out hayvanlar üzerinde yapılan çalışmalar da dahil olmak üzere hücresel metabolizma geçmiş ve şimdiki çalışmaları için en yaygın hazırlıkları biridir.

Burada bozulmamış bir yüksek derecesi ile kaplin mitokondri izolasyonu için ayrıntılı bir hızlı yöntemi açıklanmaktadır. Böyle bir hazırlık mitokondri rat kalp, fonksiyonel ve yapısal araştırma hücresel biyoenerjetik, mitokondriyal DNA, proteinler ve lipidler biyomoleküllerin, proteomik çalışmalar ve analizler taşınması için mükemmel bir nesnedir.

Protokol

Giriş

Sıçan kalp Mitokondri hücresel metabolizma geçmiş ve güncel çalışmalar için en yaygın hazırlıkları biridir. Onlar vahşi tip veya knock-dışarı hayvanların büyük miktarda hızlı ve güvenilir bir şekilde elde edilebilir. Genel prosedür tripsin, bölme ve diferansiyel santrifüj doku sindirim oluşur.

(Şekil 1) kalp de dahil olmak üzere, çeşitli dokulardan mitokondri izolasyonu sırasında tutulması gereken bazı koşullar vardır.

• Doku, elde edilen mitokondri verim doğrudan etkilediği için iyice kıyılmış vardır. Kalp dokusu küçük kavisli makas ile kıyma iyi olur ve bir doku değirmeni, yaklaşık 1.0 mm çapında çıkış delik çapı ile sarımsak basın mevcut değilse, bir Latapie doku değirmeni kullanımı ile takip edilebilir.
• Bu çözümler her adımda sıcaklığını korumak için gereklidir. Bu nedenle soğuk oda ve tüm enstrümanlar bütün prosedür yürütülecek ve çözümleri, önceden hazırlanmış ve soğutulması gerekiyor. Sıcaklık koşullarında tutulması değilse hazırlık istikrarlı çeşitli özelliklerini kaybetmiş olabilir. Mitokondrial yapısı, aktif taşıma çalışmaları önemlidir, özellikle de izin verilmez (örneğin santrifüj sırasında) süspansiyon overfreezing donmaya karşı çok hassastır.
• Önemli bir parametre prosedürün zaman uzunluğu, izolasyon mümkün olduğunca çabuk ve elde edilen hazırlık hemen kullanılmak üzere olmalıdır. Bu nedenle, cerrahi aletler, çözümleri ve cihazlar, önceden hazırlıklı olmamız gerekiyor.

Malzeme ve araçlar

Enstrümanlar

1. Düz işletim makas, sivri
2. Eğri makas
3. Forseps
4. Petri kabı
5. Küçük huni + parça naylon filtre (prewashed)
6. 6 bardak 50 ml
7. İki manyetik karıştırıcı ve iki buz banyoları
8. Bir büyük buz banyosunda
9. 2 küçük manyetik çubuklar
10. Pelet kazıma için spatula
11. Santrifüj tüpleri
12. Latapie doku basın (sarımsak basın ile ikame edilebilir)
13. 20ml teflon cam homogenisers ve 1-2ml
14. Atık beher
15. Protein tayini için son mitokondriyal süspansiyon ve örnekler için Eppendorf tüpleri
16. Buz banyosu

Çözümler (2 sıçanlarda başına hesaplanan):

1. Yıkama tamponu: 0.3 M Sakkaroz, 10 mM HEPES (pH = 7.2), 0.2 mM EDTA (1000 ml)
2. İzolasyon tamponu: 0.3 M Sakkaroz, 10 mM Hepes (pH = 7.4), 0.2 mM EDTA, 1 mg / ml BSA (Sigma A6003) (Çamaşır tampon hazırlanmış 100ml). Sığır serum albümin daha az pahalı yağ asit analogları ile ikame edilebilir. Aynı tampon ya da izotonik varyasyonlar, tampon Resuspending olarak kullanılır.
3. Tripsin (Sigma T8003) çözüm: 2.5mg/ml 1mm HCl (0.5 ml)
4. Soya fasulyesi tripsin inhibitörü (Sigma T9128) İzolasyon tamponu 6.5 mg/10 ml

Protokol

Prosedürün genel şeması Şekil gösterilir. 1. Kalpler soğutmalı ve tampon, ventriküler doku eksize kıyılmış ve tripsin ile fotolitik tedavi sırasında homojenize Çamaşır yıkanmalıdır. Süspansiyon, düşük hızda santrifüj edilir ve elde edilen süpernatant mitokondri toplamak için yüksek hızda tekrar santrifüj edilir. Resuspending tampon planlanan deneyler bağlı diğer herhangi bir izotonik solusyon tarafından değiştirilebilir.

Hayvanlar uygun olarak İngiltere ile sonlandırıldı "Animals (Scientific Procedures) Yasası." dekapitasyon takip servikal dislokasyon. Hayvan dekapitasyon hemen sonra kalp ayıklamak için gereklidir, bu nedenle hayvan fesih ve kalp çıkarma arasında herhangi bir gecikme olduğunu. Mitokondri karaciğer paralel izolasyon bekleniyor sıçanlar deney öncesinde gece aç olmalıdır.

1. Yıkama Tampon 40 ml içeren üç bardak hazırlayın. Onları bir sonraki adıma geçmeden önce 3 ila 5 dakika süreyle buz-tuz banyosu soğutun. Overfreeze ve buz kristalleri bulutları hemen sonra görünmeye başlar hemen kullanmak için değil emin olun.
2. Dekapite sıçan toraks açın ve kalp ayıklayın. Küçük kesiler olun ve hemen ardından ilk beher buz gibi bir çözüm kalp transfer. Kalp, kan kaldırmak ve ikinci behere koyun sıkın. Her kalp için bu işlemi tekrarlayın.
3. Kuru filtre kağıdı kalpleri. Tüm yağ, pıhtılaşmış kan, auricles ve fasya ve havuz ventriküler doku çıkarın.
4. Parçacıkların büyüklüğü 1-2 mm kadar yaklaşık 5 dakika buz üzerinde Petri kabı küçük kavisli makas ile toplanmış doku Kıyma.
5. Doku basın içine kıyılmış doku koyun ve passüzerinden. Önemli bir miktarda malzeme basın basın duvarları ve alttan tüm kalp dokusu toplamak kalır ki farkında olun.
6. 50 ml Yıkama Tampon behere aktarın ve karıştırın. Sonra bir naylon filtre aracılığıyla süspansiyon filtre. Çamaşır Tampon filtre 3 kez kıyılmış doku yıkayın ve süzüntü atın.
7. Yıkama Tampon 20 ml içine yıkanmış doku transferi ve manyetik karıştırıcı buz banyosu içine koyun. 0,5 ml tripsin sürekli karıştırma altında çözüm ekleyin ve Sayacı başlatmak. Başka bir manyetik karıştırıcı, buz banyosu ve ikinci bir 50 ml beher hazırlayın.
8. ^4. dakikada kısaca süspansiyon dağıtmak için yukarı ve aşağı birkaç vuruş ile gevşek takılmış küçük bir cam-teflon Homojenizatörler (10-15ml) bölümünü kullanarak süspansiyon kısmı homojenleştirme. Süspansiyon homojenleştirme sonra ikinci bir behere aktarın. ^9. dakikada, toplam süspansiyon iki kez homojenleştirme gerçekleştirmek o kadar aynı işlemi tekrarlayın. Inkübasyon 15 dakika sonra, 10 ml tripsin inhibitörü içeren tampon izole ekleyin ve 1 dakika boyunca inkübe edin.
9. Naylon filtre ile tekrar süspansiyon ve süzülen kaydetmek. Çamaşır Buffer 15-20 ml 1 dakika için bir filtre ve homojenize sol partikül fraksiyonu toplayın.
10. Homojenat süzüntü ve 600g az 15 dakika süreyle santrifüj ile birleştirin.
11. Meydana gelen supernatant, yeni bir santrifüj tüpü içine dikkatlice filtre. Pelet kirletil ve 8500g az 15 dakika tekrar santrifüj.
12. Süpernatantı yüksek hızda santrifüj sonra atmak ve 1 ml tampon atarak kabarık beyaz dış kenarı katmanı pelet 2-3 kez yıkayın. Spatula ile pelet kadar Break ama altta kırmızı nokta eritrositlerin önlemek. Kan hücreleri Loos geldiyseniz, homojenleştirme önce süspansiyon kırmızı bit kaldırın.
13. Nazik pipetleme, küçük bir Homojenizatörler veya alternatif pelletini tekrar. Daha Isolationbuffer süspansiyon seyreltilir ve 8500g az 15 dakika tekrar santrifüj.
14. Süpernatantı atın Buffer (seçim izotonik tampon) Resuspending, pelet tekrar süspansiyon haline getirin ve tekrar santrifüj.
15. Çıkan kahverengi pelet yıkanmış sağlam mitokondri içerir. Seçtiğiniz izotonik tampon çok küçük bir hacim içinde pelletini tekrar.

Şekil 1 mitokondri sıçan kalp izolasyonu adım prosedürü adım gösteren Programı. Üst kısmı, Aşamaları 1-9: doku bozulması, tripsin tedavi homojenleştirme ve alt kısmı, aşamaları 10-15: diferansiyel santrifüj.

Tartışma

Kaplin yüksek derecede sağlam mitokondri izolasyonu için Ayrıntılı hızlı protokol açıklanmıştır. Elde edilen preparat hücresel biyoenerjetik, proteomik çalışmaları veya mitokondriyal DNA analizi ve lipid içeriği fonksiyonel veya yapısal araştırma için kullanılabilir. Iyonları ve metabolik ara aktif taşıma Biyofiziksel çalışmalar da yapılabilir. Submitochondrial parçacıklar, dış membran veya oksidatif fosforilasyon arındırır ayrı bileşenden izole etmek için daha mitokondriyal hazırlık süreci mümkündür. Açıklanan yöntem Jacobus ve Saks ¹ izolasyon standart bir protokoldür bir değişiklik. Hazırlanan mitokondri beklenen verim başına mitokondriyal protein ve kalp böyle bir hazırlık malat / glutamat arasında değişmektedir solunum kontrol oranı yaklaşık olarak 10-15 mg 0.12 etrafında mol _O 2 ^xmin -1 xmg protein Devlet IV solunum ile 8 ila 12 23 ^-1 ° C 0,25 M sukroz, 10 mM KCl, 0.2 mM EDTA, 150 mcM başlatma Devlet III solunum ADP (tam deneysel koşullar ve eklemeler için, bkz. ref ile 5 mM potasyum fosfat (pH 8.0) oluşan orta ^2).

Özel dikkat izolasyon prosedürü başlamadan önce birkaç teknik detayları verilmelidir. Temiz polikarbonat veya polipropilen santrifüj tüplerine kullanılması çok önemlidir, bu nedenle tüpler temiz bir fırça ve sıcak su, deterjan Ancak tedavinin en az tutulmalıdır ile iyice yıkanmalıdır. Ayrıca, soğuk oda izolasyonu bir gün önce gerekli tüm cam ve aletleri toplamak için daha iyidir.

Izolasyon sırasında bardak için matara tamponlar aktarırken, а özel dikkat çözümler buzlu su damlaları önlemek için verilen olmalıdır. Dokuların işleme zaman kalp çıkarma hayvanın baş kesme ve soğutma doku arasında kısa süreli bir gecikme bile kısmen Kuplajsız mitokondri neden, çünkü mümkün olan en kısa sürede yapılacaktır gerektiği vurgulanmalıdır. Hızlı soğutma ve kaldırılır kalpleri iyice yıkama standart hazırlama, hemoglobin ve eritrosit NADase ücretsiz elde etmek için esastır.

Tripsin, doku duyarlılık homojenleştirme sırasında kesme kuvveti artırmak için bağlayıcı proteinlerin bozulması için kullanılır. Proteaz dokusunun uzun süreli maruz kalma, düşük kaliteli mitokondri sonuçları kaçınılmalıdır.

Yüksek hızda santrüfüj sonra santrifüj tüplerine duvarlar duvarlar üzerinde biriken yağ malzemenin herhangi bir mevduat kaldırmak için kağıt mendil ile silinmelidir.

Son tabanda için depolama (150-200 ul kalp başına tampon) sırasında, mitokondriyal fonksiyonların kaybını en aza indirmek için son tampon düşük hacimli kullanmak daha iyidir. Kalsiyum katyonların ulaşım çalışmaları için herhangi bir şelat ajanları EGTA ücretsiz orta ile birkaç kez yıkanır ve izolasyon sonrası ilk saat içinde kullanılmalıdır, böylece mitokondri son hazırlık mevcut olmalıdır.