Enzim-linked immünospot Testi (ELISPOT): Th-1 Mikrobiyal antijenlere karşı hücresel immün cevaplar Kantitasyonu

Summary

Adaptif bağışıklık idiyopatik hastalıklar mikrobik hedeflerin belirlenmesi, enzim bağlı immünospot testinin kullanımı yapılabilir.

Abstract

Adaptif bağışıklık hücre içi patojenlerin temizlenmesi için önemli bir bileşenidir. İnsanlarda bu tepkileri algılamak ve ölçmek için yeteneği önemli bir tanı aracıdır. Enzyme-linked immünospot assay (ELISPOT), transplantasyon ile HIV enfeksiyonu olanlar gibi bağışıklık sistemi baskılanmış popülasyonları ve steroid kullanımı da dahil olmak üzere, mikrobiyal antijenlere karşı hücresel immün yanıtları belirlemeye kabiliyetini popülerlik kazanıyor. Bu test spesifik mikrobiyal antijenlere karşı bağışıklık yanıtları yanı sıra, bu yanıtları karakter Th1 veya Th2 ayırt ölçmek için kapasitesine sahiptir. ELISPOT inflamasyon site ile sınırlı değildir. Bu onun yeteneği yanı sıra periferik kan, bronkoalveoler lavaj, beyin omurilik sıvısı ve assit olarak aktif katılımı siteleri içinde bağışıklık yanıtlarını değerlendirmek için çok yönlüdür. Tek veya birden fazla antijene karşı bağışıklık yanıtlarını tespiti mümkündür yanı sıra mikrobiyal proteinler içinde belirli epitoplar. Bu testte, zamanla bağışıklık yanıtlarını tespiti yanı sıra konak T hücreleri tarafından tanınır antijenleri ayrımlar kolaylaştırır. Çift renkli ELISPOT testleri aynı anda iki sitokinlerin ifade tespiti için kullanılabilir. Bu teknik için yeni uygulamalar ekstrapulmoner tüberküloz tanısı yanı sıra otoimmün hastalıklar bulaşıcı antijenlerin katkısının araştırılması.

Protocol

Aşağıdaki protokolü için, ilgi hücreleri gibi periferik kan mononükleer hücreleri (hücre) kullanın. Ancak, bu protokol, diğer hücre tipleri ile kullanılabilir . Steril tekniği kullanarak bir doku kültürü kaputun içindeki tahlil gerçekleştirin.

1. Gün: Plaka ve Hücreler Hazırlık

1. ELISPOT plaka çıkarın ve kaputu açın.
2. Varsa, aksi takdirde tek iyi pipetleme, kabul edilebilir, çok kanallı pipet kullanarak 1X PBS 150 mcL plaka, 3 kere yıkayın.
3. Rezervuarların bir paket çıkarın ve kaputu açın.
4. 2 mcg / ml yakalama antikor, anti-insan interferon-γ, 1X PBS 11 mL. Iyi Vortex. Bir rezervuar antikor karışımı aktarın.
5. Her biri de çok kanallı kullanarak 100 mcL kaplama çözüm yerleştirin.
6. Parafilm plaka sarın.
7. Bir gece buzdolabında tabak koyun. Plakalar hafta için iyi. Başparmak kuralı kuyuları sıvı sol hala varsa, plaka kullanılabilir olması.

Hücre Hazırlık

Sonra 37 PBMC'ler taze hücrelerin sayısı ve geceleme inkübe ° C,% 5 CO ₂ ile. Hücre için hücre çözülme gerekli olan, sıvı nitrojen içinde saklanır. Protokol aşağıdaki gibi:

1. 37 neredeyse tamamen çözülmüş kadar ° C su banyosunda hücrelerin cryovial çözülme.
2. Hemen R10 medya 5 ml tekrar süspansiyon haline getirin.
3. 225 x g. az 5 dakika Spin
4. R10 medya 5 ml yeniden süspanse edin ve tripan mavi kullanarak canlı hücreleri saymak.
5. R10 medya 2 x 10 ⁶ hücre / mL konsantrasyon getir.
6. ° C ile% 5 CO ₂ 37 geceleme dinlendirin.

2. Gün: Plaka Oluşturmaya

1. Örnek kimlik numarası, iyi şartlar, tarih ve etiket plakası kapak.
2. Dökümü ve blot yöntemi kullanarak, steril 1x PBS 150 mcL plaka 6 kez yıkayın. Damping ise plaka sıçrama için dikkatli olun. Bu mor plaka kuyu açmak için neden olabilir.
3. Her bir kuyunun R20 100 mcL ekleyin.
4. 37 ° C'de 1 saat süreyle plaka inkübe edin.
5. Plaka kuluçka iken, gece dinlenmiş olan hücreleri saymak.
6. 1500 rpm'de 5 dakika boyunca hücre süspansiyonu dönerler. Süpernatantı Durusu ve R10 medya 1mL başına 1x10 ⁶ hücre nihai bir konsantrasyon böylece pelet tekrar süspansiyon haline getirin.
7. 1 saat inkübasyondan sonra, R20 dökümü ve blot yöntemi kullanarak. Damping ise plaka sıçrama için dikkatli olun.
8. Her bir kuyunun 100 mcL (10 ⁵ hücreleri) hücre çözüm ekleyin. Nüsha halinde ilgili kuyulara uygun peptidler ve / veya antijenleri ekleyin. Yeni bir pipet ucu peptid çalışma çözeltisinin içine gitmek her zaman kullanın. Normal peptid konsantrasyonu 10-40 mg / ml. Peptidler değişir bu yana, her araştırmacı, optimum sonuçlar elde etmek için peptidler titre.
9. Negatif kontrol kuyularda, sadece hücreleri (peptidler)
10. Pozitif kontrol kuyularda, fitohemaglütininle (10 mg / ml; Sigma PHA) ekleyin.
11. Gece 37 ° ° C'de% 5 CO ₂ (~ 18 saat).

3. Gün: Plaka Geliştirilmesi

1. Dökümü ve blot yöntemi kullanarak 150 mcL 1xPBS plaka 6 kez yıkayın.
2. Plaka kanallı pipet kullanarak her bir kuyunun 100 mcL PBS ekleyin.
3. 15 dakika boyunca buzdolabında plaka koyun.
4. Buzdolabı plakasını alın ve doku kültürü kaputu yerleştirin.
5. Biotin antikor çözüm hazırlayın
   • 11mL PBS 0.5 mikrogram / mL biotin antikor (MAB 7-B6-1) ekleyin.
   • Vortex iyice karıştırın çözüm.
   • Eğer çok kanallı bir çözüm eklemek için planlama, bir rezervuar içine dökün.
6. Çöp sepeti içine Flicking PBS atın. Damping ise plaka sıçrama için dikkatli olun.
7. 100 mcL çözüm her bir kuyunun içine yerleştirin.
8. Bir saat boyunca oda sıcaklığında doku kültürü kaputu plaka inkübe edin.
9. Dökümü ve blot yöntemi kullanarak 150μL 1xPBS plaka 6 kez yıkayın. Streptavidin antikor hazırlanmış kadar ^6. yıkama, PBS plaka üzerinde bırakın.
10. Streptavidin antikor hazırlayın.
    • 11mL PBS (1:2000 dilüsyon) 5.5 μ l Streptavidin antikor (Streptavidin ALP) ekleyin.
    • Vortex iyice karıştırın çözüm.
    • Eğer çok kanallı bir çözüm eklemek için planlama, bir rezervuar içine dökün.
11. PBS kuyulardan kalan atın ve plaka kurulayın.
12. Streptavidin çözüm her bir kuyunun 100 mcL ekleyin.
13. 1 saat oda sıcaklığında doku kültürü kaputu plaka inkübe edin.
14. Plakalar PBS dökümü ve blot yöntemi ile 6 kez yıkayın. Renk çözüm yaptık kadar ^6. yıkama, plaka PBS bırakın.
15. Karanlıkta çalışın. Alkalen fosfataz substrat çözeltisi (Alkalin Fosfataz Yüzey Kit IV BCIP / NBT) hazırlayın:
    • Substrat reaktif 1-11 ml Tris tamponu, iyi vorteks 4 damla ekleyin. Tris tamponu, iyi vorteks substrat reaktif 2 4 damla ekleyin. Tris tamponu, iyi vorteks substrat reaktif 3 4 damla ekleyin.
16. Kalan PBS atın ve plaka kurulayın.
17. Plaka çok kanallı kullanarak her bir kuyu için renk çözüm 100 mcL ekleyin.
18. 5 ila 10 dakika renk geliştirdikten sonra ışığı açın.
19. Mor lekeler açmak için başlar ve oldukça koyu renk reaktifleri kadar plaka kalmasına izin verin. Bu yerden 5 ila 20 dakika sürer. Bunu yaparken yüksek arka plan neden olabilir, çünkü çok uzun substrat çözeltisi bırakmayacak şekilde dikkatli olun.
20. ELISPOT plaka 3 kez musluk suyu ile yıkayın.
21. Yaklaşık bir saat veya gece boyunca kurumaya bırakın.
22. Elle veya ELISPOT plaka okuyucu ile plaka okuyun.
23. Işığa maruz plaka uzak bir kutu içinde saklayın.

Temsilcisi Sonuçlar:

ELISPOT mikrobiyal antijenlere karşı bağışıklık tepkileri ölçmek için tasarlanmıştır. Her nokta, tek bir yanıt veren hücre ilgi sitokin ifade gösterir. Noktalar elle veya bir ELISPOT plaka okuyucu kullanarak sayılabilir.

ELISPOT doğru yapılmış olduğunu Değerlendirme arka plan ilgi sitokin üretimi için negatif kontrol soruşturma ile başlamalıdır. Küçük bir arka plan (mor renkli) olabilir, ancak negatif kontrol kuyularında bir noktalar görmeyi bekliyorum. Tipik olarak, bir de başına beş noktalar ortalamasından daha az olmalıdır. Pozitif kontrol kuyuları tepki doğru olduğunu onaylayın ve hücrelerin antijenik stimülasyon duyarlı olduğunu. Pozitif kontrol kuyularında noktalar k (fiekil 1) bir izdiham nedeniyle derin bir mor arka planı görmek için beklenebilir. Hiçbir beyaz arka plan az olmamalıdır. Pozitif kontrol ve negatif kontrol örnekleri uygun değilse, bir sonra ilgi antijen içeren kuyu güvenebilirsiniz. "Optimal" sonucu yüksek arka plan (kuyu mor), hiçbir noktalar ya da çok az sayıda lekeler, boş merkezi, yetersiz tanımlanmış noktalar veya confluent lekeler yansıması olacaktır. Sorun giderme ipuçları listesi (Tablo 1).

Şekil 1 ELISPOT plaka bir temsilcisi. Her plaka pozitif kontrol, negatif kontrol ve en az iki kuyularda yapılan faiz peptid içermelidir. Koyu mor bir renk, konfluent hücreleri ve neredeyse hiç beyaz bir arka plan var gördüğünüz gibi C9, C10, D9 ve D10, pozitif kontrol kuyuları vardır. Negatif kontrol kuyuları, G11, G12, H11 ve H12. Bu kuyular mor bir arka plan ve beklendiği gibi herhangi bir noktalar var. Noktalar G7, G8, H7 ve H8, mikrobiyal peptidler hücresel yanıtları göstermek mor lekeler ilgi sitokin ifade eden bir tek duyarlı hücre temsil eder.

Tablo 1

Gözlem	Olası Sorun	Olası Çözüm
Yüksek arka plan	1. Membran Her iki taraf da doğru yıkanmış değil 2. Çok sayıda hücre salgılayan sitokin 3. Plaka düzgün kurutulmuş yanlış 4. Aşırı gelişmiş plaka	1. Renk gelişimi öncesi ve sonrası, distile su ile zarının her iki taraf yıkayın. Reaktifler zarından plaka taban içine sızabilir ve yıkanıp değilse bu yüksek arka plan neden olabilir. 2. De her bir hücre sayısını azaltın, bu optimizasyon gerekecektir 3. Okumadan önce plaka uzun Kuru 4. Gelişmekte olan zamanı azaltın
Çok az lekeler / Spotlar yok	1. Salgılayan sitokin / ilgi protein, yeterli hücre 2. Doğru hücreler uyarılır olun 3. L inkübe hücreleryeterli ong veya uyarıcı cevap vermek için zaman alabilir 4. Yetersiz renk gelişimi 5. Yeterince birincil ya da ikincil antikoru	1. Hücre sayısını artırın. Bu optimizasyon gerekecektir 2. Ayrıca olumlu bir stimülasyon kontrol sitokin / ilgi protein ifadesi neden olacak bildiğiniz bir uyarıcı - 3. Hücre inkübasyon süresi artırın veya dolaylı yöntemi (uyarıcı tedavi ile ön hücreleri) kullanabilirsiniz 4. Havai bir mikroskop ile renk gelişimini izlemek ve gelişmekte olan reaktiflerin doğru saklanır ve aktivite kayıp değil sağlamak 5. Birincil ve / veya sekonder antikor konsantrasyonu artırılması gerekmektedir. Bu optimizasyon gerektirir.
Boş Alanları	1. Membran önceden tedavi edilmezse 2. Membran bazı aşamada kuruduktan 3. Hücreler dengesiz dağıtılmış	1. Emin olun zarı yeterince% 70 etanol (membranlar bu tedarikçi ile kontrol gerekmez) ile ön işlem. Daha sonra PBS 3X ile iyice yıkayın 2. Membran kuru değildir olun 3. Kuyulara pipetleme önce iyi bir homolog hücre süspansiyonu hücreler yavaşça karıştırınız olun
Boş Merkezi	1. Yıkama hasar	1. Otomatik yıkama (ya da pipetleme) Akış hızı çok yüksek olabilir. Daha yumuşak bir yıkama prosedürü ihtiyacınız var
Yanlış Pozitif	1. Sekonder antikor agrega 2. Hücreler hala membran 3. Hücre kültürü kirlenmesine	1. Filtre ikincil antikor 2. Tüm hücreleri sekonder antikoru inkübasyon önce PBS Tween 20 ile membran yıkanır olun. Membran sol hücreler düzensiz şekilli noktalar verecektir 3. Reaktifler steril ve mümkün olduğunca temiz tutun. Hücre kültürü tekniği steril olduğundan emin olun. Bir medya negatif kontrol çalıştırarak yanlış pozitif olup olmadığını kontrol edin. Plaka hareket için, yetersiz tanımlanmış noktalar
Konfluent Spotlar	1. Zavallı kaplama, çok fazla antikor 2. Uzun süreli hücre kültürü 3. Hücreleri üzerinde uyarılmış	1. Primer antikor konsantrasyonunu azaltacak 2. Hücrelerin ne kadar uzun süre inkübe edilir, daha fazla sitokin / protein salgılanır. Bu birleştirme ve ayırt edilemez hale başlayacak büyük noktalar neden olacaktır. 3. Hücre kültürü adım inkübasyon süresi azaltın. Aşırı stimülasyon sitokin / hücre tarafından salgılanan protein bir sürü neden olacaktır. Bu birleştirme ve ayırt edilemez hale başlayacak noktalar üretecektir. Kısa bir zaman miktarı için, kültür ortamı veya kültür uyarıcı miktarını azaltın
Yeteri kadar Tanımlı Spotlar	1. Membran önişlemden (membran gerektiriyorsa, tedarikçi ile kontrol) 2. Hücre inkübasyon sırasında Plaka hareketi	1. Membran, etanol ya da bu bulanık, kötü tanımlı noktalar yol açabilir önceden tedavi edilmelidir. Okuyucu bu ayırt etmek zor olacak 2. Taşındı hücrelerin birden fazla spot yaratacaktır plaka hücre inkübasyon sırasında taşımak için izin vermeyin. İnkübasyon sırasında açılmayacaktır adanmış bir inkübatör kullanmak. Plak hücreler ekledikten sonra dokunmayın
Pozitif Kontrol kuyuları düşük.	1. Azgelişmişlik - oda sıcaklığına getirilmelidir henüz Streptavidin-ALP ve / veya BCIP / NBT çözümleri kullanarak bir sonucu olabilir	1. Reaktifler kuyulardan eklemeden önce oda sıcaklığına getirin
Yoğunluk lekelerin zor onları ölçmek için yapar	1. Çok sayıda hücre kuyulara ilave edildi	1. Ayrı lekelerin oluşumuna neden olacaktır hücre optimal sayısını belirlemek için hücre dilüsyonları (yani, 1 de ortalama x 10 6, 5 x 10 5, 1 x 10 5, 5 x 10 4, 1 x 10 4 hücreleri)

Discussion

ELISPOT testi insanlarda bağışıklık yanıtlarını izlemek için en önemli ve en yaygın olarak kullanılan testlerin biri olarak ortaya çıktı ve diğer türlerin bir çeşitlilik vardır. ELISPOT testi ile, bağışıklık hücre frekansları hücre popülasyonlarının genişleme veya manipülasyon olmadan tek hücre düzeyinde ölçülebilir. ELISPOT testinin yaygın enfeksiyon, kanser, alerji ve otoimmün hastalıklar da dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda antijen spesifik bağışıklık yanıtlarını araştırmak için uygulanmıştır. Bu testin uygulam...

Materials