Yöntem makalesi

Büyük Ölçekli Zebra balığı Tabanlı In vivo Küçük Molekül Ekran

DOI:

10.3791/2243

⸱

30 Aralık 2010

 ,  ,  , 
1Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine, Vanderbilt University School of Medicine, 2Department of Pharmacology, Vanderbilt University School of Medicine, 3Vanderbilt Institute of Chemical Biology, Vanderbilt University School of Medicine, 4Research Medicine, Veterans Affairs TVHS, Vanderbilt University School of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebra balığı güçlü olarak ortaya çıkmıştır In vivo Fenotip tabanlı ilaç ekranları kimyasal ve genetik analiz platformu. Burada, küçük moleküller zebrafish embriyoları kullanılarak büyük ölçekli tarama için basit, pratik bir yöntem gösteriyor.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

, Küçük embriyo boyutu, hızlı bir gelişme, şeffaflık, doğurganlık ve memeliler için çok sayıda moleküler, morfolojik ve fizyolojik benzerlikleri göz önüne alındığında, zebrafish güçlü olarak ortaya çıkmıştır

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1) Zebra balığı Yumurta Toplama

  1. Kimyasal ekran gün önce öğleden sonra, 10 ila 20 Zebra balığı üreme tankları kurdu. Her bir tank su ile yetiştiricilik sistemi doldurun. Bir balık ağı kullanarak, her bir yetiştirme tankında iç konteyner bir yetişkin erkek ve 01:59 yetişkin kadın aktarın. Bir bölücü ile erkek ve dişi balık birbirinden ayırın. Kafesleri Etiket ve üzerlerine bir kapak koydu.
  2. Ekranın sabah, üreme tankları bölücüler kaldırmak ve çiftleşmek için zebrafish izin. Önceki 1 saat boyunca, döllenmiş yumurta her iç konteyner alt kısmında ızgara üzerinden düşmesine izin vermeyin.
  3. 1 saat sonra, kalıcı depolama tankları yetişkin zebrafish geri dönüş iç kabı çıkarın ve bir plastik çay süzgeci ile her bir yetiştirme tankında su süzme yumurta toplamak.
  4. Petri kabı üzerinden süzgeci ters çevirin ve E3 orta içeren bir yıkama şişesi kullanarak Petri kabı içine yumurtaları temizlemek için yavaşça süzgeç durulayın.
  5. Opak görünür tüm döllenmemiş yumurta, tek bir plastik pipet kullanarak çıkarılmalıdır. Her çiftleşme çapraz yaklaşık 200 embriyolar verim gerekir.

2) 96-kuyu Tabaklar Embriyolar Arraying

  1. 5, 96 plaka bir cam Pasteur pipeti kullanarak her bir kuyunun içine E3 ortamda embriyolar hakkında aktarın.
  2. Embriyo ponksiyon bakım alarak, pipet embriyolar 96-plaka üzerine dizilmiş, bir 12-kanal (300 mcL 30) kullanarak kuyuların mümkün olabildiğince kadar E3 orta kaldırmak. 12-kanallı pipet kullanarak, böylece embriyolar kadar kuruması için izin vermemek için de mümkün olduğunca çabuk, her 0.5μg/ml kanamisin içeren E3 orta 250 mcL sunmak.
  3. 96-kuyucuğu bileşikler eklenecek zaman istenilen aşamaya ulaşmak kadar 28.5 ° C inkübatör içine koyun.

3) Küçük Molekül Kütüphanesi Devri

Bileşik transferi robotik transfer yöntemleri ile otomatik olabileceği gibi, biz manuel aktarma yöntemini anlatacağız.

  1. Küçük molekül kütüphaneleri, tipik olarak 10 mM stok olarak DMSO saklanan her bileşik ile, 96-well formatında temin edilmektedir. Bileşikler eklenecek embriyolar aşamaya ulaşmak yaklaşık 60 dakika önce, küçük moleküller aynı hacimde (kaynak plaka) içeren 96-kuyucuğu İstediğiniz bir numarayı Çözülme. Kaynak plakaların seri veya diğer kimlik numarası dikkate alınız. Plakalar üzerinde yoğunlaşma en aza indirmek için, buz eritme Drierite (WA HAMMOND DRIERITE CO, Xenia, OH) içeren bir kuruma odasında oluşabilir.
  2. Kısaca çok plaka adaptörü ile donatılmış bir masa üstü santrifüj plakaları dönerler.
  3. Kaynak plaka alüminyum sızdırmazlık bantı çıkarın. 12-kanallı pipet kullanarak, kaynak plaka bileşiklerin konsantrasyonu 0.5 mM (örneğin, 250 nL alikotları 10mM stok ile başlayan, her bir kuyunun 4.75 mcL DMSO eklemek) seyreltin.
  4. 96-plaka embriyoların (alıcı plaka) istenilen aşamaya ulaşmak, alıcı plakalar içeren kaynak plakaları bileşiklerin 2.5μL (0.5mm) aktarmak için bir 12-kanal (2-20 mcL) pipet kullanın embriyoların.
  5. Alıcı embriyo plakalar üzerinde kaynak plakalarının kimlik numarasını kaydedin. Kapak kapakları ile embriyoların ve bileşikleri içeren alıcı plakaları, yavaşça yavaşça dönen plakalar karışımı, ve 28.5 ° C inkübatör koyun.
  6. Uzun süreli saklama için -80 ° C derin dondurucuda alüminyum sızdırmazlık bantı ve yer ile kullanılmayan küçük moleküller (0.5 mM) içeren her kaynak plaka Kapak.

4) Küçük Moleküllerin Etkileri fenotipleri Görsel Muayene Tarama

  1. Ekranın gerçekleştirmeden önce, ne bir "hit" teşkil edeceğini için belirli bir kriter formüle.
  2. Gelişimi istenilen zamanlarda, inkübatör bileşik tedavi edilen embriyolar içeren 96-kuyucuğu çıkarın ve bir stereomikroskop altında her iyi incelemek. Dolaşım desen değişiklikleri gibi ince değişiklikler, daha iyi bir görünüm için, ters faz-kontrast mikroskop kullanılabilir. Floresan mikroskobu, bir doku spesifik organizatörü altında GFP veya DsRed proteinleri ifade pertürbasyon incelemek için kullanılabilir.
  3. 5 embriyo en az 3 öngörülen "hit" fenotip sergileyen herhangi bir kuyu için 96-kuyucuğu hızla tarayın. Kimlik, plaka ve her potansiyel hit iyi bir konuma kaydedin.
  4. Çeşitli dozlarda (1 UM, 5 UM, 10 mcM ve 50 mcM) bileşik etkileri yeniden test potansiyel bir hit teyit. Her doz için 48 plaka formatında E3 medya 0.5 ml, 10 embriyolar test edilmektedir. Test için bileşik Ayrıca zamanlama orijinal tarama aynı olmalıdır. Hit ortaya çıkardı fenotip compoun, yeniden test yeniden teyitd
  5. Küçük moleküllerin kimyasal kütüphane veritabanı isabet bileşik belirleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebrafish bazlı kimyasal ekran planlama yaparken özellikle dikkat sağlamlık fenotip ve arka plan gibi fenotip oranı dikkate alınarak ödenmelidir. Bu kimyasal bastırıcılar kaynaklı bir fenotip ekranlar için özellikle önemlidir. Örneğin, bir transgen ısı-şok indüksiyon kaynaklanan bir fenotip, fenotipe neden olan durum tekrarlanabilir kabul edilemeyecek kadar yüksek yalancı pozitiflik oranları önlemek için tam ekran başlamadan önce eşlenmiş olmalıdır. Dikkatli bir planlama ile, mütevazı bir sermaye yatırımı gerektirir zeb...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Çıkar çatışması ilan etti.

Malzemeler

  1. En az 20 çift istenilen genotip yetişkin zebrafish.
  2. Balık ağları, Hayvancılık tankları, çıkarılabilir iç konteyner ve bölücüler (Aquatic Habitat).
  3. Petri kapları (10 cm).
  4. Plastik çay süzgeci.
  5. Şişe containg embriyo su yıkayın.
  6. Tek kullanımlık polietilen transferi pipetler.
  7. Polistiren 96-iyi yuvarlak alt test plakaları (Corning Costar Lowell, MA).
  8. Cam Pasteur pipeti (Fisher Scientific).
  9. Manuel pipet pompası, 10 ml (Bel-Sanat Ürünleri, Pequannock, NJ).
  10. E3 embriyo orta:% 0.003 PTU (phenylthio-karbamit, Sigma, St Louis, MO) içeren 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl 2, 0.33 mM MgSO 4,. PTU 1 L E3 embriyo medya 0.3 g PTU eriterek 10x bir çözüm olarak hazırlanabilir. PTU içeren Çözümleri alüminyum folyo ile kaplayarak ışıktan korunmalıdır.
  11. 12-kanallı pipetler, 2-20 mcL (Eppendorf).
  12. 12-kanallı pipetler, 3-300 mcL (Eppendorf).
  13. Tek kullanımlık polistiren pipet havzası, 50 ml (Fisher Scientific).
  14. DMSO 10 mM stok az 96 wll formatında dizilmiş yapısal olarak farklı bileşiklerin küçük molekül kütüphanesi. Her ana plaka 96-iyi polipropilen depolama levhalar (Corning) aliquoted ve -80 ° C kullanana kadar saklanır.
  15. Alüminyum (Nunc, Rochester, NY) 96-kuyucuğu için bant mühürleme.
  16. DMSO (Sigma, St Louis, MO).
  17. Temel inkübatör, 28.5 ° C (Fisher Scientific).
  18. Iletilen ışık tabanı (Leica Microsystems, Bannockburn, IL) ile stereomikroskopta.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bayliss, P. E. Chemical modulation of receptor signaling inhibits regenerative angiogenesis in adult zebrafish. Nature chemical biology. 2, 265-273 (2006).
  2. Burns, C. G. High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate. Nature chemical biology. 1, 263-264 (2005).
  3. Hao, J. In vivo structure-activity relationship study of dorsomorphin analogues identifies selective VEGF and BMP inhibitors. ACS chemical biology. 5, 245-253 (2010).
  4. Hong, C. C., Peterson, Q. P., Hong, J. Y., Peterson, R. T. Artery/vein specification is governed by opposing phosphatidylinositol-3 kinase and MAP kinase/ERK signaling. Curr Biol. 16, 1366-1372 (2006).
  5. Milan, D. J., Peterson, T. A., Ruskin, J. N., Peterson, R. T., MacRae, C. A. Drugs that induce repolarization abnormalities cause bradycardia in zebrafish. Circulation. 107, 1355-1358 (2003).
  6. Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 12965-12969 (2000).
  7. Yu, P. B. Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism. Nature chemical biology. 4, 33-41 (2008).
  8. Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature reviews. 4, 35-44 (2005).
  9. Stern, H. M. Small molecules that delay S phase suppress a zebrafish bmyb mutant. Nature chemical biology. 1, 366-370 (2005).
  10. Peterson, R. T. Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation. Nature biotechnology. 22, 595-599 (2004).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Zebrafish Embriyo TaramaK k Molek l K t phanesiKimyasal Genetik Analiz96 Kuyucuklu PlakaEmbriyonik Geli im DeneyiFenotip Temelli TaramaHedgehog Yola nhibisyonuKimyasal TaramalarEmbriyo Toplamank bat r Protokol

İlgili makaleler