Sıçanlarda Aktif Gecikmiş tip aşırı duyarlılık (DTH) İndüksiyon ve İzlenmesi

Özet

Gecikmiş tip aşırı duyarlılık (DTH) CCR7-efektör bellek T lenfositlerin aracılık ettiği inflamatuar bir reaksiyon. Burada Lewis sıçanlarda aktif DTH neden ve inflamatuar yanıt nasıl izleneceğini gösteriyor.

Özet

Gecikmiş tip aşırı duyarlılık (DTH), bağışıklık sisteminin astarlanmalıdır karşı antijen enjeksiyonu site sızmaya CCR7 efektör bellek T lenfositleri aracılık ettiği inflamatuar bir reaksiyondur. Inflamatuar reaksiyon antijenik meydan yerinde kızarıklık ve şişme ile karakterize edilir. Immunsupresanların in vivo etkinliğini belirlemek için uygun bir model. Kutanöz DTH, antijen-spesifik T lenfositlerin evlatlık havalesi ile veya antijen ile aktif bağışıklama ve inflamatuar reaksiyon, belirli bir cilde alanda ikna etmek için antijen ile daha sonraki intradermal meydan tarafından başlatılabilir. DTH yanıtları örneğin ovalbumin, tüberkülin, tetanoz toksoidi ya da anahtar deliği limpet hemosiyanin (KLH), çeşitli antijenleri ikna edilebilir.

Burada nasıl ikna etmek için Lewis sıçanlarda aktif bir DTH reaksiyon göstermektedir. Önce, bizim ilgi antijen, KLH Freund adjuvan tam bir su-yağ emülsiyonu hazırlamak ve bu emülsiyon sıçanlara subkutan enjekte. Bu KLH yönlendirilmiş bellek T hücreleri geliştirmek için bağışıklık sistemini başbakan. Yedi gün sonra diğer tarafta, bir tarafta ve ovalbumin, ilgisiz bir antijen ile KLH ile geri intradermal sıçanlarda meydan okuyacaktır. Inflamatuar reaksiyon 16-72 saat sonra görülebilir ve kırmızı ve şişmiş alan DTH şiddetinin bir göstergesi olarak ölçülen olacaktır.

Protokol

1. Emülsiyon hazırlanması

1. Emülsiyon antijen 1:1 karışımı (DTH çeşitli antijenleri ikna edilebilir ovalbumin, tetanoz toksoidi, sulu çözelti içinde anahtar deliği limpet hemosiyanin ....) Freund adjuvan tamamlamak için eklenen. Bu antijen adjuvan ve başka bir yol boyunca eklemek için çok önemlidir!
   
   
2. Yapma ve bir emülsiyon enjekte atık bir sürü vardır, bu nedenle her zaman ihtiyacınız olandan 1.5 ya da 2 kez daha fazla hazırlamak.
   
   
3. 2 mg / ml solüsyon hazırlamak için tuzlu antijen çözülür. Agregaların gevşek istemiyorum, filtre etmeyin!
   
   
4. Yüksek hızda bir tüp ve vorteks Freund adjuvan H37Ra (Difco, katalog # 231.131) tamamlamak koyun. Vorteks ise antijen damla damla ekleyin. antijen eklenir, 5 dakika daha karıştırın. Karışımı beyaz açmalısınız.
   
   
5. Bir cam şırınga koyun ve emülsiyon (Fisher katalog # 14-825-17L) 18G köprü kullanarak başka bir cam şırınga bağlamak. (5-10 dk) sabit hale gelinceye kadar, diğer bir şırınga emülsiyon gönder. Iki 5 ml şırınga kullanmak en iyisidir. En fazla 5 ml emülsiyon gerekiyorsa, 5 ml enjektör birkaç setleri kullanın.
   
   
6. Emülsiyon şırınga 4 ° C'de 3 hafta süreyle saklanabilir.

2. Sıçan, Bağışıklama

1. Birkaç dakika için şırınga emülsiyon karıştırın ve enjeksiyon için kullanılan şırınga transfer. 23G iğneler ve bir Luer-Lok ucu 3 ml şırınga kullanarak kuyruk dibinde 1-2 sitelerinde subkutan 200 ml enjekte edilir.

3. Geri antijen ile Mücadelesi

1. Bağışıklama Yedi gün sonra sıçanların sırtında 2 noktalar tıraş ve bir diğer nokta nokta ve tuzlu (veya ilgisiz antijen), 1 mg / ml antijen çözüm intradermal 20 ml enjekte. Inflamatuar reaksiyon geliştirmek agregaların gevşek olarak, antijen çözüm filtre yapmayın.
   
   
2. Sıçanlarda hareketleri önlemek için anesthesized olmalıdır. 27G ½ iğneleri ve 1 ml şırınga kullanarak çözüm intradermal enjekte edilir. Enjeksiyonlar arasında iğne değiştirin.
   
   Not: zorluk, daha hassas ölçümler için arka yerine kulak kepçesi yapılabilir . See video https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=325

4. DTH, ölçümü

1. Enjeksiyon yerinde kırmızı dönüm ve inflamasyonun bir işareti olarak şişme başlayacaktır. Bir cetvel ya da daha iyisi, bir kaliper ile iltihaplı bölgenin çapı ölçün. 24 ve 72 saatleri arasında maksimum şişme meydana gelmelidir.

Tartışma

DTH reaksiyon daha hassas bir ölçüm için, kulak kepçesi antijen ile sıçan zorlu tavsiye ederiz. Reaksiyon sonra kulakta şişme ilgili antijen-meydan kulak ve kulak ya da serum fizyolojik tek başına ya da alakasız bir antijen ile meydan arasında bir fark olarak ölçülür. Kulak meydan okuma bir gösteri 1'de gösterilmiştir.

Malzemeler