Omurilik Yaralanmasını İncelemek için Yenidoğan Sıçanında Kortikospinal Nöronlara Hedeflenen Viral İletim

Özet

Kaynak: Smit, RD, et al. Kombine Beyin ve Omurga Cerrahisi Kullanılarak Çift Viral Vektör ile Yenidoğan Sıçanlarda Kortikospinal Sistemin Hedeflenmesi. J. Vis. Uzm. (2021)

Bu video, yenidoğan bir sıçanda viral vektörlerin kortikospinal nöronlara hedefli olarak verilmesini göstermektedir. Protokol, anterograd ve retrograd viral enjeksiyonlar kullanarak kesin gen ekspresyonunu mümkün kılarak, omurilik yaralanmasını takiben nöral rejenerasyon ve plastisite araştırmalarını kolaylaştırır.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Akson terminallerini hedefleyen omuriliğe doğrudan enjeksiyonlar

1. Cam enjeksiyon iğnesinin ucunu kullanarak, omurilik arterini tanımlayarak omuriliğin orta hattını yaklaşık olarak tahmin edin. Bununla birlikte, spinal arter belirgin şekilde merkez dışındaysa veya herhangi bir şekilde sapıyorsa, C2 spinöz sürecinin konumunu kullanarak ve bunu omurganın uzunluğu boyunca tahmin ederek orta hatta yaklaşın.
   NOT: Bir parça parafilm üzerine ~ 5 μL pipetleyerek virüsü enjektöre yükleyin ve iğneyi, uç virüs damlacığının üzerine dayanacak şekilde konumlandırın.
2. Tanımlandıktan sonra, iğneyi yaklaşık orta hatta C5 laminanın hemen arkasına yerleştirin ve bunu referans noktası olarak kullanın. Ardından, mikromanipülatörü kullanarak iğneyi yanal olarak 0,3 mm sağa hareket ettirin. İğneyi omuriliğin yüzeyine değene kadar indirin; Bu derinlikten iğneyi omuriliğe 0,6 mm daldırın. Gerekirse, omuriliği delene kadar iğneyi daldırmaya devam edin; Ardından, iğneyi uygun derinliğe geri çekin veya indirin.
3. 250 nL / dk'da 1 μL retro adeno ilişkili virüs2-scCre enjekte edin. Enjeksiyon tamamlandıktan sonra, iğneyi yavaşça çekmeden önce virüsün omuriliğe yayılması için 2 dakika bekleyin. Enjeksiyonları, aynı yanal ve derinlik koordinatlarını kullanarak, omurga penceresi içinde, biri orta noktada ve sonuncusu T1 laminasının hemen önünde olmak üzere iki bölgede daha tekrarlayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Esnek İğne Ataşmanı	World Precision Instruments	MF34G-5	Cam iğneleri temizlemek ve cam iğnelere kırmızı yağ yüklemek için.
Cam Kılcal Borular	Dünya Hassas Aletler	4878	Çekilmiş cam iğneler için - nanolitre enjektörler için tasarlanmalıdır.
Vernier Ölçekli Mikromanipülatör	Kanetec	N/A	Ameliyat sırasında hassas hedefleme için.
Lab Standart Stereotaksik Alet	Çalma	51600	Yenidoğan sterotoksik tutucuyu yerinde
Lab Standard with Mouse & Neonates Adaptör		51615	Kraniyal cerrahi ve spinal enjeksiyonlar sırasında yenidoğan kafatası fiksasyonu için
Işık ve Sürmeli Ölçekli Mikroskop Oküler	Leitz Wetzlar	N/A	Çekilmiş cam kılcal boruların fonksiyonel cam iğnelere eğimini görselleştirmek ve ölçmek için kullanılır.
MicroSyringe Pump Controller	World Precision Instruments	62403	Enjeksiyon hızını kontrol etmek için.
Nanolitre 2000 Pompa Kafası Enjektör	Dünyası Hassas Aletler	500150	Virüsü kontrollü bir şekilde yüklemek ve enjekte etmek.
pAAV-CMV-scCre	Wu lab		Cre plazmid
pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (plazmid #44361)	Bryan Roth'un Addgene		DREADD aracılığıyla laboratuvarı plazmid
PrecisionGlide İğneleri (25G x 5/8)	Becton, Dickinson and Company	305122	Hayvan modelinin enjeksiyonuna izin vermek için 1 mL ve 10 mL şırıngalarla kullanım içindir.
Sıçan Diş Forseps	Roboz	RS-5152	Dikenli süreçleri kavramak için.
Steril Salin	Baxter Healthcare Corporation	281324	Kan temizliğinde kullanım ve ameliyat sonrası sıvıların değiştirilmesi için.
Cerrahi Eldivenler	N/A	N/A	Ameliyat sırasında steril alanı korumak için cerrah tarafından kullanılır.
Cerrahi Isıtma Yastığı	N/A	N/A Ameliyat	sırasında hayvan modelinin vücut ısısını korumak için.
Cerrahi Mikroskop	N/A	N/A	Cerrahi yaranın daha iyi görselleştirilmesi için.

tutmak için