$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
- Mikroenjeksiyon şırıngasının ve mikroenjektörün enjeksiyon için hazırlanması:
- Her gaz geçirmez mikroenjeksiyon şırıngasını mikroenjeksiyon pompasının rafına kilitleyin.
- Gaz geçirmez şırınganın ucunu küçük bir kantarda bulunan steril suya yerleştirin ve iç teli yağlamak için pistonu hafifçe çırpın. Su ile doldurmak için pistonu pompanın arka durdurucusuna eşit şekilde çekin.
- Mikroenjektöre bağlı PE20 hortumunu, steril suyla doldurulmuş 26 ml'lik bir şırıngaya bağlı 1 G (kahverengi göbek) iğneye kaydırın. Mikroenjektörden steril su püskürtün ve püskürtme düzenini ve mesafesini kontrol edin.
NOT: Su, mikroenjektör ucundan çok uzağa ve doğrudan püskürtülmelidir. Akış düz değilse, enjeksiyon yeri doğru olmayacaktır. - Sterilize edilmiş mikroenjektörü steril bir alana yerleştirin.
- Suyun dışarı damlamasını önlemek için mikroenjektör borusunu dik tutarak hortumu iğneden kaydırın ve aynı zamanda hortumu iğneden zarar gören alanın altından kesin.
- İğnenin ucunda bir damlacık oluşturmak için mikroenjeksiyon şırınga pistonunu hafifçe ileri doğru itin ve su dolu PE20 borusunu (mikroenjektöre bağlı) iğnenin üzerine kaydırın.
NOT: Bu, mikroenjektörün ucunda oluşabilecek bir tıkanıklığı yerinden çıkarabilecek uygun bir geri basınca izin verecek bir sıvıdan sıvıya bağlantı oluşturacaktır. - Numune yüklemeye hazırlanmak için pistonu tamamen ileri doğru itin ve mikroenjektörde eser miktarda etanol kalmadığından emin olun.
- Mikroenjektörün ucunda oluşan su damlacığını temiz bir laboratuvar mendiline birkaç kez dokundurarak kurulumda sızıntı olup olmadığını kontrol edin.
- NOT: Laboratuvar mendiline dokunurken yalnızca bir ıslak nokta oluşmalıdır. Daha fazla damla varsa, sistemde bir sızıntı vardır.
- Süper yapıştırıcı uygulamasını kontrol ederek ve PE20 borusu herhangi bir bağlantıdan çıkarıldığında PE20 borusunu keskin bir makas veya tıraş bıçağıyla keserek sızıntıları önleyin.
- Şırınga pistonunu 0,2 μl geri çekin; PE20 tüpü / mikroenjektöründeki steril su ile enjekte edilecek çözelti arasında bir kabarcık oluşturun.
- NOT: Bu kabarcık, enjeksiyonun seyreltilmesini, suyun kirlenmesini önler ve enjeksiyon sırasında hareket edeceği için enjeksiyon işleminin izlenmesine izin verir. Tek bir katı baloncuk üretilmelidir.
- Mikroenjektörü enjekte edilecek reaktife yerleştirin ve şırınga pistonunu yavaşça geri tepme ucuya çekin.
- Bir hayvanı enjeksiyon için hazırlamak:
- Farenin göğsünü deneycinin göğsüne karşı tutun. Kanüllerin etrafındaki alanı %70 etanole (h/h) batırılmış bir pamuk aplikatör ile temizleyin.
- NOT: Doğru kullanımla, fareler kapalı bir elde nazikçe tutulabilir. Aksi takdirde, tırmalama gerekebilir.
- Küçük forseps kullanarak obturatörleri çıkarın ve %70 etanol (h/v) içeren tartı teknesine yerleştirin.
- Enjeksiyonların yapılması:
- Doldurulmuş mikroenjektörü kanülün içine yerleştirin. Mikroenjeksiyon pompasında başlat düğmesine basın ve kabarcık hareketini izleyin.
- NOT: Mikro enjektörlerin kalkmamasını sağlamak için hafif basınç uygulamak gerekebilir. Kabarcık düzgün bir şekilde ilerlemeli ve mikroenjektöre tam olarak girmelidir.
- Enjeksiyon tamamlandıktan ve enjeksiyon sonrası difüzyon süresi geçtikten sonra mikroenjektörleri kanülden çıkarın ve obturatörleri değiştirin.
- NOT: Tipik enjeksiyon sonrası difüzyon süreleri farmakolojik reaktifler için 2-4 dakika ve virüsler için 2-10 dakikadır. İnfüzyon sonrası dönemde mikroenjektörü içeride bırakmak, enjekte etmenin dokuya yayılmak yerine kanülleri geri akıtmasını önler. Etanolün kanüle yeniden yerleştirilmeden önce boşalmasını sağlamak için etanol dolu tartı teknesinin yan tarafına obturatörler yerleştirin.