Kök Hücre Kaynaklı Nöronal Progenitörlerin İnsan Kortikal Dilimlerine Nakli

Özet

Kaynak: Palma-Tortosa, S., et.al. İnsan Kök Hücre Nakli ve Validasyonu için Ex vivo Model Olarak Yetişkin İnsan Korteksinin Organotipik Kültürleri. J. Vis. Uzm. (2022)

Bu video, kök hücre kaynaklı nöronal progenitör hücrelerin insan kortikal doku dilimlerine naklini göstermektedir. Prosedür, bir bazal membran matrisinde progenitör hücrelerin izole edilmesini ve yeniden askıya alınmasını, ardından bunların bir transwell düzeneğine yerleştirilen kortikal bir dilime enjekte edilmesini içerir. Matris katılaşmasına ve nöronal farklılaşmaya izin vermek için inkübasyondan sonra, nakledilen doku daha ileri analizler için hazırlanır.

Protokol

Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Lt-NES hücrelerinin çoğalması ve farklılaşması

NOT: insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevli uzun süreli kendi kendini yenileyen nöroepitel benzeri kök (lt-NES) hücreler, kurucu bir promotör (GFP-lt-NES hücreleri) altında yeşil floresan protein (GFP) taşıyan bir lentiviral vektör ile üretilir ve dönüştürülür. 3 x 10⁶ hücre içeren şişeler kullanılana kadar −150 ° C'de saklanır.

1. Stok çözeltilerinin ve media

1'in hazırlanması. 10 μg bazik fibroblast büyüme faktörünü (bFGF) 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) -% 0.1 sığır serum albümini (BSA) içinde 10 μg / mL'lik bir stok konsantrasyonuna sahip olacak şekilde seyreltin. 100 μL alikot hazırlayın.

2. 10 μg/mL'lik bir stok konsantrasyonuna sahip olmak için 10 μg epidermal büyüme faktörünü (EGF) 10 mL PBS-%0.1 BSA içinde seyreltin. 100 μL alikot hazırlayın.

3. Aliquot başına 100 μL'lik bir hacimde 50x B27 takviyesi.

4. 100 μg/mL'lik bir stok konsantrasyonuna sahip olmak için 10 mg poli-L-ornitini 100 mL deiyonize su içinde seyreltin. 1 mL alikot yapın.

5. 1.20 mg / mL fare laminininden 30 μL alikot hazırlayın.

6. 10 mL tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) (%0.25) 90 mL PBS içinde %0.025'lik bir stok konsantrasyonuna seyreltin. 1 mL alikot hazırlayın.

7. 0.025 g tripsin inhibitörünü 50 mL PBS'de 0.5 mg / mL'lik bir stok konsantrasyonuna seyreltin. 1 mL alikot hazırlayın.

8. 10 μg / mL'lik bir stok konsantrasyonuna sahip olmak için 1 μg Wnt3a'yı (Kanatsız tip MMTV entegrasyon sitesi aile üyesi 3A) 1 mL PBS-0.1% BSA içinde seyreltin. BMP4'ü (kemik morfogenetik proteini 4) aynı şekilde hazırlayın. 100 μL'lik bir hacme aliquot.

9. 1 mg siklopamini 2,5 mL dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 400 μg/mL'lik nihai konsantrasyona seyreltin ve 100 μL alikot yapın.

10. Temel ortamı (Tablo 1) ve farklılaşma tanımlı ortamı (DDM, Tablo 2) hazırlayın ve 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.

2. Kültür kaplarının kaplanması

1. Proliferasyon veya farklılaşma sırasında GFP-It-NES hücrelerini kültürlemek için bulaşıkları önceden kaplamak için, poli-L-ornitin 1:100'ü deiyonize suda seyreltin ve bir T25 şişesine 5 mL çözelti ekleyin. Gece boyunca oda sıcaklığında (RT) inkübe edin.

2. Poli-L-ornitin kaplı plakaları 1 adet deiyonize su ile ve 1 adet PBS ile yıkayın.

3. Proliferasyondaki GFP-It-NES hücreleri için, fare lamininini PBS'de 1:500'de seyreltin ve 37 °C'de en az 2 saat inkübe edin. Farklılaşmadaki GFP-It-NES hücreleri için, fare lamininini PBS'de 1:100'de seyreltin ve 37 °C'de en az 2 saat inkübe edin.

3. GFP-lt-NES hücrelerinin çoğalması

1. İki farklı 15 mL tüpte 5 mL (yıkama için) ve 5 mL (tohumlama için) bazik ortamı ısıtın.

2. Bir şişe GFP-lt-NES hücresini 37 °C'de hızla çözdürün, yıkama tüpüne aktarın ve 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.

3. Peletlere dokunmadan ortamı dikkatlice aspire edin ve hücreleri 1 mL önceden ısıtılmış bazik ortamda yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu, proliferasyon faktörleri ile desteklenmiş temel ortamı içeren tohumlama tüpüne aktarın: EGF (10 ng/mL), bFGF (10 ng/mL) ve B27 (10 ng/mL). Hücreleri poli-L-ornitin / laminin kaplı bir T25 şişesine tohumlayın.

4. Hücreleri her gün çoğalma faktörleriyle besleyin. Ortamı sararırsa değiştirin. Hücreleri her üç veya dört günde bir geçirin (% 100 birleşmeye ulaştıktan 1 gün sonra).

4. Proliferasyon ve farklılaşma için GFP-lt-NES hücrelerinin bölünmesi

1. Şişe başına 5 mL bazik ortamı (hücreleri toplamak için) ve ayrıca onları yeniden tohumlamak için gereken toplam hacmi önceden ısıtın.
NOT: Geçiş, hücreleri çoğalmada tutmak için 15 mL bazik ortam gerektiren 1:3 seyreltmede yapılır ve farklılaşmayı başlatmak için 30 mL bazik ortam gerektiren 1:6 seyreltmede yapılır.

2. Ortamı aspirasyon ile hücre kültürü şişesinden çıkarın ve 500 μL önceden ısıtılmış %0.025 tripsin ekleyin. RT'de 5-10 dakika inkübe edin. Hücrelerin ayrılması, 10x büyütmede standart bir ışık mikroskobu altında doğrulanabilir.

3. Eşit hacimde tripsin inhibitörü (0.5 mg / mL nihai konsantrasyon) ve ardından 5 mL ılık bazik ortam ekleyin. Hücreleri nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyerek ayırın ve toplayın. Hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.

4. Hücreleri proliferasyonda tutmak için, proliferasyon faktörleri ile desteklenmiş taze bazik ortamda 1: 3 seyreltmede yeniden plakalayın ve adım 1.3.4'ü tekrarlayın.

5. GFP-lt-NES hücrelerinin kortikal farklılaşması

1. 0. günde, hücreleri (farklılaşma için kullanılmak üzere) proliferasyon faktörleri ile desteklenmiş 30 mL bazik ortamda yeniden süspanse edin ve bunları altı farklılaşma kaplı T25 şişesine (bölünmüş 1: 6) yerleştirin.

2. 1. günde, ortamın yarısını DDM olarak değiştirin ve konsantrasyonlarının yarısına proliferasyon faktörleri ekleyin.

3. 2. günde, ortamı tamamen farklılaşma faktörleriyle desteklenmiş DDM'ye değiştirin: BMP4 (10 ng/mL), Wnt3a (10 ng/mL) ve siklopamin (400 ng/mL).

4. 4. günde, farklılaşma faktörlerini tek başına ekleyin. Ortamı sararırsa değiştirin.

5. 6. günde, ortamı BMP4 ve Wnt3a ile desteklenmiş DDM olarak değiştirin. Siklokamin bu adımda çıkarılır.

6. 7. günde, hücreleri adım 1.4.2 ve adım 1.4.3'te belirtildiği gibi ayırın.

2. GFP-lt-NES hücrelerinin organotipik hACtx dilimlerine nakli

NOT: Yetişkin insan kortikal (hACtx) dokusu, hücre naklinden önce 1 hafta boyunca kültürlenmelidir. Transplantasyon prosedürünü kolaylaştırmak için, dokunun yüzmesini önlemek için ekin üstünden 2 mL hACtx ortamının çıkarılması gerekir.

1. Kortikal olarak astarlanmış GFP-lt-NES hücrelerini (adım 1.5.6'dan itibaren) soğuk saf bazal membran matrisinde (Malzeme Tablosuna bakınız) 1 x 105 hücre / μL konsantrasyonda yeniden süspanse edin ve çözeltiyi daha küçük bir steril tüpe aktarın.

NOT: Nakil işlemi sırasında, jel katılaşmasını önlemek için tüm malzemeler (pipet uçları, tüpler, kılcal damar vb.) önceden soğutulmalıdır. Kullanmadan önce bazal membran matris jelini 30 dakika buz üzerinde çözdürün.

2. Hücre süspansiyonunu, emme için kauçuk bir emziğe bağlı soğuk bir cam kılcal damara toplayın. Yarı kuru doku dilimini çeşitli bölgelerden bıçaklayarak hücre süspansiyonunu küçük damlalar halinde (her biri yaklaşık 1 μL) enjekte edin.

3. Jelin katılaşması için 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Plakayı inkübatörden tekrar kaputa aktarın ve dokuyu tamamen daldırmak için ekin üstüne dikkatlice 2 mL hACtx ortamı ekleyin.

4. Kültür ortamını haftada bir kez taze hACtx ortamı ile değiştirin.

Sonuçlar

Tablo 1: lt-NES hücrelerinin proliferasyon ortamının bileşimi (bazik ortam).

Temel Orta	Stok konsantrasyonu	L-Glutamin	100 mL
DMEM / F12 başına	nihai konsantrasyon 1x		98.7 mL

ile

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
İNSAN NEOKORTIKAL DOKUSUNUN BAKIMI VE
KÜLTÜRÜ 6 oyuklu plaka	ThermoFisher Scientific	140675
Alvetex iskele 6 kuyulu Reinnervate	Ltd	AVP004-96
B27 Takviyesi (50x)	ThermoFisher Scientific	17504001
Fenol Kırmızısı	Kök Hücre teknolojileri içermeyen BrainPhys	#05791	Metinde nöronal ortam olarak atıfta bulunulmuştur
Filtre birimleri 250 mL veya 500 mL	Corning Sigma	CLS431096/97
Forseps	Herhangi bir uygun
Gentamisin (50 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	15750037
Glutamax Takviyesi (100x)	ThermoFisher Scientific	35050061	Metinde L-glutamin olarak atıfta bulunulmuştur
Kauçuk emzik + Cam pipet	Herhangi bir uygun
lt-NES hücrelerinin ÜRETİLMESİ
2-Merkaptoetanol 50 mM	ThermoFisher Scientific
Hayvansız Rekombinant EGF	Peprotech	AF-100-15
B27 Takviyesi (50x)	Thermo Fisher Scientific	17504001
bFGF	Peprotech	AF-100-18B
Sığır Albümin Fraksiyonu V (%7,5 çözelti)	ThermoFisher Scientific	15260037
Siklopamin, V. kalsifornikum	Calbiochem	# 239803
D (+) Glikoz çözeltisi (%45)	Sigma	G8769
Dimetil sülfoksit (DMSO)	Sigma Aldrich	D2438-10mL
DMEM/F12	ThermoFisher Scientific	11320074
Dulbecco'nun Fosfat Tampon Salin (DPBS)	Thermo Fisher Scientific	14190-144	Kalsiyum ve magnezyum
içermez Laminin Fare Proteini, Doğal	Thermo Fisher Scientific	23017015
MEM Esansiyel olmayan amino asit çözeltileri (100x)	ThermoFisher Scientific	11140050
N-2 Takviyesi (100 x)	ThermoFisher Scientific	17502001
Poli-L-Ornitin	Merk	P3655
Rekombinant İnsan BMP-4 Protein	Ar-Ge Sistemleri	314-BP-010
Rekombinant İnsan Wnt-3a Protein Ar-Ge	Sistemleri	5036-WN
Sodyum Piruvat (100 mM)	ThermoFisher Scientific	11360070
Soya Fasulyesi Tripsin İnhibitörü, toz	Thermo Fisher Scientific	17075029
Steril deiyonize su	MilliQ		MilliQ filtre sistemi
Tripsin EDTA (% 0.25)	Sigma	T4049-500ML
HÜCRE KÜLTÜRÜ EKİPMANLARI
Ayarlanabilir hacimli pipetler 10, 100, 200, 1000 μL	Eppendorf	Çeşitli
Temel membran matrisi ESC nitelikli (Matrigel)	Corning	CLS354277-1EA
Santrifüj	Hettich Santrifüj	Rotina 420R	%5 CO2, 37 °C
İnkübatör	ThermoForma Steri-Cult CO2	HEPA Class100
Kök hücre kesme aleti 0.190-0.210 mm	Vitrolife	14601
Steril tüpler	Sarstedt	Çeşitli
Steril Tek Kullanımlık Cam Pastör Pipetleri 150 mm	VWR	612-1701
Steril pipet uçları 0.1-1000 μL	Biotix VWR	Çeşitli
Steril Serolojik Pipetler 5, 10, 25, 50 mL	Costar	Çeşitli
T25 şişeleri Nunc	ThermoFisher Scientific	156367

31350010