Bir fare modelinde stabil genetik modifikasyon için virüslerin stereotaksik enjeksiyonu

Özet

Kaynak: Porlan, E., et al. Nöral Kök Hücre Özerk ve Özerk Olmayan Etkilerin Analizi için Yetişkin Fare V-SVZ'de Hücrelerin Kararlı ve Verimli Genetik Modifikasyonu. J. Vis. Uzm. (2016)

Bu video, bir fare modelinde virüs taşıyan bir terapötik genin stereotaksik enjeksiyonu yoluyla ventriküler-subventriküler bölgedeki (V-SVZ) nöral kök hücrelerin (NSC'ler) stabil genetik modifikasyonunu göstermektedir. Virüs NSC'lere girer, ters transkripsiyona uğrar, genoma entegre olur ve nöroterapötik uygulamalar için stabil ve verimli genetik modifikasyon sağlar.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Lateral Ventrikülün (LV) Ventriküler-Subventriküler Bölge (V-SVZ) / Striatum Sınırına veya LV'nin LV Mikroenjeksiyonuna Stereotaksik Enjeksiyonu

<

1. ol style='list-style-type:decimal;'>
2. Ameliyat için gerekli aletleri seçin ve sterilize edin (neşter, matkap ve küçük cımbız).
3. 6-8 haftalık bir fareyi intraperitoneal (ip) veteriner denetimli bir ketamin ve medetomidin karışımı enjekte ederek anestezi yapın. Her hayvanı tartın ve her birine fare vücut ağırlığının kg'ı başına 50-75 mg ketamin ve 0.5-1 mg medetomidin dozu verin (fare başına yaklaşık 100-125 μl ketamin / medetomidin çalışma çözeltisi).
4. Ayak parmaklarını, kuyruğu veya kulağı sıkıştırarak ve hayvanın reaksiyon göstermediğinden emin olarak anestezik düzlemi değerlendirin.
5. Fare anestezi uygulandıktan sonra, ameliyat sonrası ağrıyı en aza indirmek için fare ağırlığının kg'ı başına 0.4-0.5 mg'lık bir son dozda butorphanol'ü deri altına enjekte edin.
6. Kulaklar arasındaki alanı tıraş edin ve iyodopovidon veya% 70 etanol gibi bir iyodofor kullanarak cildi dezenfekte edin. Steril pamuk uçlu aplikatörler kullanarak temizleyin. Hayvanı aşırı derecede ıslatmamaya dikkat edin, çünkü bu hipotermiyi şiddetlendirebilir.
7. Hayvanı stereotaksik bir çerçeve üzerine yüzüstü pozisyonda yerleştirin ve kulak çubuklarını ve aparatın damak desteğini kullanarak kafayı dikkatlice sabitleyin. Fareyi 37 °C'ye ayarlanmış bir ısıtma yastığı ile tutun ve gözlere oftalmik kayganlaştırıcı uygulayın.
8. Bir neşter kullanarak kafa derisinde uzunlamasına 1 cm uzunluğunda bir kesi yapın ve ince cımbız kullanarak kafatasını ortaya çıkarmak için cildi nazikçe geri çekin.
9. Kemik yüzeyini steril pamuk uçlu bir aplikatör ile dikkatlice temizleyin. Kalan dokudan açıkta kalan kafatası kemiğini temizleyin.
10. Şırınga tutucuyu kullanarak sterilize edilmiş şırıngayı stereotaktik cihaza monte edin.
11. Şırınga tutucusunu x, y ve z eksenleri boyunca, şırınga iğnesinin ucu, sagital (uzunlamasına ve medial) sütürün koronal sütür ile dik olarak kesiştiği bağlantı noktası olan bregma üzerine gelene kadar hareket ettirin (Şekil 1b). Dorso-ventral (DV) eksenin "sıfır" pozisyonunun bregmada kafatası yüzeyinde olduğundan emin olun.
12. Şırıngayı x ve y hedef koordinatlarına taşıyın (bkz. Tablo 1 ve Şekil 1b).
13. Daha sonra enjeksiyon bölgesine geri dönebilmek için x, y ve z hedef koordinatlarını Vernier ölçeğinde açıklama ekleyin. Cerrahi bir işaretleyici kalem kullanarak kemiği x ve y koordinatlarında işaretleyin.
14. Şırıngayı çalışma alanından uzaklaştırın.
15. Elektrikli bir matkap kullanarak, beyne zarar vermemek için kafatasında dikkatlice bir delik açın. Beyin yüzeyine zarar verebileceğinden piyal yüzeyi delmeyin.
16. Şırıngaya 1 μl 10⁶ TU / μl (mikrolitre başına dönüştürücü birim) viral çözelti yükleyin. Ucu 10-12° açıya sahip 33 gauge keskin eğimli bir iğne kullanın. Şırınga iğnesini beyin yüzeyine göre 90° açıyla konumlandırın.
17. Şırıngayı enjeksiyon bölgesine geri getirin ve uç piyal yüzeye temas edene kadar aşağı doğru hareket ettirin.
18. Şırınga ile beyne DV eksenindeki z koordinatına nüfuz edin.
19. Aşırı sıvı basıncı nedeniyle beyin dokusuna verilen hasarı en aza indirmek için viral süspansiyonu 0.2 μl/dk hızında yavaşça serbest bırakın.
20. Viral süspansiyonun geri akışını en aza indirmek için 5-10 dakika bekleyin ve ardından şırıngayı çok yavaş bir şekilde geri çekin.

District of injection	Koordinatlar
	Antero-posterior (AP)	Medio-lateral (ML)	Dorso-ventral (DV)
SEZ/striatum sınırı	+0.6 mm	+1.2	mm-3.0 mm
Lateral ventrikül-0.3	mm	+1.0	mm-2.6 mm

Tablo 1: Enjeksiyonlar için stereotaksik koordinatlar. Antero-posterior (AP) ve medio-lateral (ML) eksenler için, x ve y koordinatları bregmadan uzaklık (mm cinsinden) olarak verilir. "-", "arkaya doğru" anlamına gelir. DV koordinatları için "sıfır", bregma noktasındaki kafatasının yüzeyidir ve DV koordinatları bu noktadan aşağı olan mesafeyi (mm cinsinden) gösterir.

Sonuçlar

Şekil 1: Prosedürün farklı bölümlerinin şematik gösterimi. (a) İnsan embriyonik böbrek 293T (HEK293T) hücrelerinin LV'leri oluşturmak için uygun plazmitlerle transfeksiyonundan, belirtilen formül kullanılarak akış sitometrisi ile virüs titresinin belirlen...

Malzemeler