Bir Embriyonik Fare Modelinde In Utero Nanoenjeksiyon Yoluyla Nöral Plaka Hücre Manipülasyonu

Özet

Kaynak: Mangold, K., H el. al., Embriyonik Günde In Utero Nano-Enjeksiyon (NEPTÜN) ile Murin Nöral Plaka Hedefleme 7.5. J. Vis. Uzm. (2022)

Bu video, embriyonik bir fare modelinde nöral plaka hedefleme için rahim içi nano enjeksiyon yöntemini göstermektedir. Amniyotik boşluğa yüksek titreli bir lentiviral çözelti enjekte edilir, burada nöral plaka hücrelerine entegre olur ve nörogelişimsel araştırma ve terapötik uygulamalar için stabil gen manipülasyonu sağlar.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Enjeksiyonlar

NOT: Bu prosedürde kullanılan tüm aletler ameliyattan önce ve her fare arasında sterilize edilir.

1. İdeal büyüklükte boşlukları olan ilk kadını uyuşturun.
2. Dişi masanın üzerine yerleştirin ve sabitleyin.
3. Kornea kurumasını önlemek için gözlere göz jeli uygulayın ve deri altına ağrı kesici enjekte edin.
   NOT: Önerilen analjezikler: Buprenorfin (0.05-0.1 mg / kg vücut ağırlığı) veya Fluniksin (2.5 mg / kg) veya yerel hayvan refahı yönetmeliklerine uygun olarak benzeri. Multimodal perioperatif analjezi, enjekte edilen analjezikler ve izofluran ile sürdürülür.
4. 0.5 mg / mL klorheksidin çözeltisi (veya benzeri) ile ıslatılmış bir bezle silerek alt karın bölgesini aseptik olarak hazırlayın ve cildi kurulayın. Alt karın bölgesinde 1.5-2.0 cm'lik dikey orta hat cilt kesisi yapmak için cerrahi makas kullanın.
   NOT: Cerrahi alanı yerel olarak onaylanmış dezenfeksiyon rutinlerine göre hazırlayın.
5. Ameliyattan sonra dikiş atmayı kolaylaştırmak için cildi nazikçe kaldırın ve cildi kesi noktasının yaklaşık 1 cm çevresinde alttaki kas tabakasından kurtarın.
6. Kas tabakasına 1 cm'lik dikey orta hat kesisi yapın.
7. Bir çift forseps ile cildin ve kas tabakasının bir tarafını kaldırın ve diğer çift ile rahim boynuzlarını arayın.
   NOT: Yaprak dökenler bir kolye üzerindeki boncuklar gibi düzenlenirken, bağırsak uzun, sürekli bir tüptür (Şekil 1A).
8. Forseps ile her iki uterus boynuzunu da karından dikkatlice çıkarın. Dokuyu embriyolar arasında tutun; doğrudan sıkmayın (Şekil 1B).
   NOT: Rahim vücuda rahim ağzından bağlanır ve iki yumurtalık/yumurta kanalı bağlar yoluyla bağlanır. Rahmi bu ankraj noktalarından çekmeyin/ayırmayın.
9. Sol ve sağ taraftaki embriyo sayısını sayın ve not edin.
10. Embriyoları yumurtalıktan rahim ağzına veya rahim ağzından yumurtalığa kadar numaralandırın.
    NOT: Bu, özellikle enjekte edilen embriyolar embriyonik aşamalarda toplanacaksa önemlidir.
11. Nemli bir pamuklu çubukla, enjekte edilecek ilk üçü hariç tüm embriyoları nazikçe karın boşluğuna geri itin.
12. Petri kabındaki elastikin üzerine bir damla PBS (fosfat tamponlu salin) damlatın ve hemen embriyoların üzerinde tutun.
13. Kapalı forsepsleri elastik insizyona yerleştirin ve elastik insizyonu açmak için forsepsleri serbest bırakın, böylece sıvı embriyoların üzerine düşer.
    NOT: Bu, embriyoların rehidrasyonunu ve elastik zarın dişinin ıslak cildine yapışmasını sağlayarak sonraki adımlarda PBS sızıntısını önler.
14. Uterusun üç embriyoya karşılık gelen bir bölümünü forseps ile elastikten çekin ve Petri kabını dişinin karnına hafifçe tünetin.
15. Forseps ve nemli bir pamuklu çubukla, PBS sızıntısını önlemek için elastikin dişinin cildine sızdırmaz hale getirildiğinden emin olmak için uterus pozisyonunu ve elastiki ayarlayın.
16. Petri kabını karnın hemen üzerine sabitlemek ve sabitlemek için dört kil ayağı kullanın, bu da kadın üzerindeki baskıyı ve dişinin nefes almasına ve kalp atışına görüntüleme hassasiyetini azaltır.
17. Uterusu sabitlemek için modelleme kil silindirini embriyoların/uterusun sağına doğru bastırın (Şekil 1C).
    NOT: Bu yönlendirme talimatı, iğnenin dişinin solunda olduğunu ve dişinin sol uterus boynuzundaki embriyoların açıkta olduğunu varsayar. Uterusun yan tarafı (sol veya sağ uterus boynuzu) çok önemlidir, çünkü Amniyotik (AC) ya iğneye bakar (sol boynuz; Şekil 1D) veya dengeleyici kil silindire bakar (sağ boynuz; Şekil 1E).
18. Embriyoları sağ rahim boynuzundan enjekte etmek için, kil silindirini embriyoların sol tarafına yerleştirin (Şekil 1F) ve doğru yönlendirmeyi elde etmek için ısıtma tablasını 180° çevirin (Şekil 1G). Bunun yerine iğne hareket ettirilebiliyorsa, ilgili kurulum için uygun şekilde uyarlayın.
19. Embriyolar ve uterus PBS ile kaplanana kadar Petri kabına PBS ekleyin.
20. Ultrason probunu PBS'ye indirin ve enjeksiyonların kaydedilmesini kolaylaştırmak için fare/ameliyat masasını, ilk embriyo ultrason probu ile hizalanacak şekilde ayarlayın.
    NOT: "İlk", yumurtalıktan rahim ağzına kadar embriyoların numaralandırılmasını ifade eder.
21. Her üç embriyoyu da tarayın ve AC'leri inceleyin. Enjeksiyon hacmini aşağıdaki gibi belirleyin:
    1. Ultrason makinesi ile AC'nin çapını ölçün. AC çapı ≤0,2 mm ise 69 nL enjekte edin; AC çapı >0,2 mm ve ≤0,29 mm ise 2 x 69 nL (= 138 nL) enjekte edin; ve AC çapı 0,29 mm ise 3 x 69 nL (= 207 nL) enjekte > (Şekil 1H).
       >NOT: Önceki deneyler, E7.5'te 207 nL'ye kadar enjeksiyon hacminin iyi tolere edildiğini göstermiştir. Sağkalım üzerinde minimum etkiye sahip başarılı enjeksiyonlar, AC'nin nispi hacim artışı% 90'ı aşmadığında elde edilir. Littermatlar veya fare suşları arasında AC boyutundaki değişiklik yaygındır ve daha fazla optimizasyon gerektirebilir.
22. Enjeksiyon kontrolörü ile enjeksiyon hacimlerini ayarlayın.
23. 23 nL/s.
    enjeksiyon hızıyla enjeksiyon hızını yavaşlatın NOT: Farklı ekipman modelleri farklı enjeksiyon kuvvetlerine neden olabilir.
24. Ray sistemindeki ana tekerlekleri (x ve z düzlemleri, Şekil 1I) kullanarak iğneyi PBS'ye indirin ve sıvı iğne ucuna ulaşana kadar nanoenjektör kontrol cihazında Boş'a basın.
    NOT: İğne tıkanmışsa, Boş'a basmak tıkanıklığı çözebilir ve/veya tıkanıklığı dışarı atabilir.
25. İğneyi PBS'den kaldırın ve Enjekte Et'e basın. İstenen yaklaşık hacimde bir damlanın boşaltıldığını doğrulayın.
26. İğneyi PBS'ye indirin ve nanoenjektörü mikromanipülatör üzerindeki y-düzlem tekerleği ile hareket ettirerek ultrason probu ve embriyo ile hizalayın (Şekil 1J).
    NOT: İğne ucu, ultrason görüntüsünde parlak bir nokta olarak göründüğünde mükemmel şekilde hizalanır (Şekil 1K,L). İğne, mikromanipülatör ile her üç yön düzleminde de hareket ettirilebilir.
27. Rahim duvarına göre dike yakın bir enjeksiyon açısı sağlamak için enjeksiyon açısı tekerleği ile iğne açısını ayarlayın. Mikromanipülatör üzerindeki enjeksiyon çarkını kullanarak iğneyi tek hareketle AC'ye yerleştirin (Şekil 1J-M). İğne ucu parlaklığına dikkat edin. İğne ucu ultrason görüntüsünden kaybolursa, iğneyi tekrar odaklamak için ultrason probunu ileri veya geri hareket ettirin.
    NOT: İğne AC'nin içine girdikten sonra, embriyoya zarar vermeden iğne pozisyonunda ve odağında küçük değişiklikler yapılabilir (~ 0,3 mm içinde ayarlamalar). İğne konumunu bundan daha fazla ayarlamayın.
28. Enjekte Et'e basın (207 nL için ses seviyesini 69 nL'ye ayarlayın ve üç kez enjekte edin). Enjeksiyondan sonra, iğneyi hafif bir hareketle geri çekmeden önce 5-10 saniye daha bekleyin.
29. Aşamayı bir sonraki embriyoya taşıyın ve uygun AC boyutlarına sahiplerse diğer iki embriyo için 1.22-1.26 adımlarını tekrarlayın.
30. Mikromanipülatörü kullanarak ultrason probunu ve iğneyi PBS'den kaldırın. Hasar ve yaralanmayı önlemek için iğneyi operatörden uzaklaştırın.
31. Forseps ile 1. ve 2. embriyoları elastikten nazikçe iterek dişinin karnına geri yönlendirin. 3. embriyoya bitişik dokuyu nazikçe kavrayın ve uterusu elastik insizyonun üst ucuna doğru çekin. 4.-6. embriyoları forseps ile nazikçe yukarı çekin ve 3. embriyonun tekrar karın içine girmesine izin verin.
    NOT: Bu adım, PBS'yi değiştirmeden veya Petri kabı çıkarılmadan yapılabilir.
32. Optimal AC'lere sahip tüm embriyolar enjekte edilene veya zaman sınırına ulaşılana kadar gerektiği kadar tekrarlayın.
33. Embriyoları / uterusu nazikçe dişinin karnına geri itin.
34. PBS'yi aspire edin ve Petri kabını çıkarın. Bir virüs kullanılmışsa, onu bulaşıcı atık olarak ele alın.
35. Kas tabakasını Vicryl (USP 6-0, iğne uzunluğu 13 mm, 3/8 Daire) ile basit sürekli veya kesintili dikişlerle dikin ve cildi 1-2 klipsle kapatın (Malzeme Tablosuna bakınız).
36. İzofluran pompasını kapatın.
37. Cerrahi bandı çıkarın ve dişiyi yüzüstü pozisyonda (göbek aşağı) 40 °C'lik bir ısıtma plakası üzerinde temiz bir kafese yerleştirin.
    NOT: Dişinin 10 dakika içinde bilincini geri kazanması ve hareketli olması beklenir. İşlemin 30 dakika içinde tamamlandığından emin olun. Kadının genetik geçmişi, yaşı ve kilosu anesteziye duyarlılığı etkileyebilir. Ameliyat sırasında fareleri yavaş nefes alma (yavaş nefes alma, anestezinin çok derin olduğu anlamına gelir) veya hareket (anestezinin çok hafif olduğu anlamına gelir) belirtileri açısından izleyin. Buprenorfin (0.05-0.1 mg/kg vücut ağırlığı) veya Fluniksin (2.5 mg/kg) veya benzeri, yerel hayvan refahı düzenlemelerine uygun olarak, gerekirse ilk enjeksiyondan 8 saat sonra sağlanabilir.
38. Başka bir dişiye enjekte edilecekse, ilkinin uyanışını izlerken cerrahi alanı hazırlayın.
    1. Cerrahi aletleri %70 etanol ile silin ve kalan kan veya dokuyu çıkarın ve önceden ısıtılmış cam boncuk sterilizatöründe 10 saniye sterilize edin. Pamuklu çubukları atın ve kağıt mendil kullanın. Petri kabını ve kil parçalarını kağıt mendil ile kurulayın.
39. Tüm dişiler enjekte edilene kadar 1.1-1.35 adımlarını tekrarlayın.
40. İğneyi boşaltın ve atın.
    1. İğnede bir virüs veya enjeksiyon solüsyonu kalmışsa, nanoenjektörde Boşalt'a basın ve iğnenin içeriğini kağıt mendil üzerine boşaltın.
    2. Kontrolörden pistonun tamamen geri çekildiğini gösteren çift bip sesi gelene kadar Doldur'a basarak metal pistonu tamamen geri çekin.
    3. Pensi gevşetin ve iğneyi metal pistondan kaydırın. İğneyi kesici alet atık kabına atın.
41. BSL-2 (Biyogüvenlik Seviye 2) tezgahını temizleyin.
    1. Bir virüs kullanılmışsa, tüm cerrahi alana dezenfektan püskürtün (Malzeme Tablosuna bakın). 15 dakika sonra dezenfektanı silin ve tüm cerrahi alanı %70 etanol ile temizleyin. Virüs kullanılmamışsa, tüm yüzeyleri %70 etanol ile temizleyin.
    2. Ultrason probundan kalan PBS'yi kuru, yumuşak, tüy bırakmayan kağıt mendille silin.
42. Atıkları biyogüvenlik yönergelerine göre atın.
43. Ultrason makinesini, ısıtma masasını, BSL2 tezgahını ve O₂ beslemesini kapatın.

Sonuçlar

Şekil 1: Başarılı enjeksiyonlar için amniyotik boşluğun optimal boyutu ve oryantasyonu. (Bir) Kalın bağırsağa (üst) kıyasla bir küre dizisi (altta) şeklinde birden fazla E7.5 desidua içeren uterus boynuzu. (B)...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1 mL Şırınga	BD Bioscience	309628
27 G İğne	BD Bioscience	300635
3.5 inç kılcal damarlar	Drummond Scientific	3000203G/X	Ev iğnelerini çekmek için kullanıldı
70 MHz MS Serisi dönüştürücü	Visual Sonics	MS700
Aquasonic şeffaf ultrason jeli	Parker Laboratories	Mar-50
Autoclip Aplier 9 mm	Angthos	12020-09
CD1 fareler	Charles River, Almanya	Crl:CD1(ICR)	Dişiler: 8 haftalıktan itibarenErkekler: 12 haftalıktan itibaren
Pamuklu Çubuk	OneMed Sverige AB	120788
DPBS	Gibco	14190094
Pansuman forseps narin düz 13 cm	Agnthos	08-032-130
EZ klipsler 9 mm	Angthos	59027	Klipsler
İris Makas, Süper Kesim, düz, 9 cm	Agnthos	307-336-090
İzofloran	Baxter Medical AB	EAN:	50085412586613 İsveç Eczanesi'nden satın alındı
Kimmendil	Kimberly Clarke	7557
Membran Bant	Visual Sonics	SA-11053
Mikropipet Çektirme	Sutter Aleti	P-97
Modelleme Clay	Sense AB	10209
Fare İşleme Masası	Görsel Sonics	50249
Nanoject II Otomatik Enjektör Kiti	Drummond	3-000-205A
Parafilm	Bemis	HS234526C
Merkezi açıklıklı Petri kabı (alçak duvar)	Visual Sonics	SA-11620
Petri kabı, (ØxH): 92 x 16 mm	Sarstedt	82.1472.001
Virkon DuPont'a Güven+On		130000132037	dezenfektan
Silikon membran	Visual Sonics	SA-11054
Steri 250, sıcak boncuk sterilizatörü	Angthos	31100
Cerrahi Bant (1,25 cm x 9,14 m)	Medicarrier	67034
Vevo Compact Dual (Med. Air & O2) Anestezi Sistemi	Visual Sonics	VS-12055
Vevo Görüntüleme İstasyonu 2	Görsel Sonics	VS-11983
Vevo2100	Görsel Sonics	VS-20047
Vicryl 6-0; C-3 iğne, 45 cm mor filament	Agnthos	J384H