Elektroporasyon ile Kemirgen Siyatik Sinirinin Schwann Hücrelerine Gen Transferi

Özet

Kaynak: Ino, D. et. al., Elektroporasyon ile Kemirgen Siyatik Sinirindeki Schwann Hücrelerine İn Vivo Gen Transferi. J. Vis. Uzm. (2016)

Bu video, elektroporasyon kullanılarak kemirgen siyatik sinirinin Schwann hücrelerine in vivo gen transferini göstermektedir. Sinire bir plazmit DNA-boya çözeltisi enjekte edilir ve elektrik darbeleri DNA girişini kolaylaştırır. DNA daha sonra hücrenin genomuna entegre olur ve Schwann hücrelerinde başarılı gen transferini sağlar.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

Plazmid DNA'nın Hazırlanması

1. Tamamlayıcı DNA (cDNA) veya kısa firkete RNA (shRNA) dizisini memeli hücreleri için bir ekspresyon plazmidine alt klonlayarak in vivo elektroporasyon için DNA plazmitleri oluşturun. Güçlü ve stabil ekspresyona izin verdiği için bir sitomegalovirüs hemen erken arttırıcı ve tavuk β-aktin promotör füzyonu (CAG) promotör güdümlü plazmid kullanın. Bir CAG promotörünün, kontrolü altında shRNA'ların ekspresyonu için, shRNA'yı alt klonlamak için mir30 tabanlı bir shRNA kaset sistemi kullanın.
2. Plazmid DNA'yı üreticinin talimatlarına göre bir maxi-prep kiti ile saflaştırın ve DNA'yı HEPES tamponlu salin (140 mM sodyum klorür, NaCl, 0.75 mM di-sodyum hidrojen fosfat, Na₂HPO₄, 25 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES); pH 7.40) ile yeniden süspanse edin. DNA konsantrasyonunu ≥4 μg/μl'ye ayarlayın.
3. Plazmid DNA çözeltisini 4 μg/μl'lik bir konsantrasyona hazırlayın ve enjeksiyon bölgesini etiketlemek için minimum miktarda hızlı yeşil boya (nihai konsantrasyon %0.01) ekleyin. Birden fazla plazmitin eşzamanlı elektroporasyonu gerektiğinde, plazmit DNA çözeltisinin toplam konsantrasyonunu 4 μg/μl'ye ayarlayın.
   NOT: Plazmid DNA'ların optimal bileşimi, her bir plazmitin transfeksiyon verimliliğine göre belirlenmelidir.

2. Cerrahi Aletlerin ve Salin

1. Otoklav cerrahi aletlerinin sterilizasyonu ve% 0.9 NaCl çözeltisi.

3. Cam Mikropipetin Hazırlanması

1. Bir pipet çektirme kullanarak cam pipetleri çekin. Pipetin ucunu 30-50 μm çapında kesin. Aşağıdaki parametreleri kullanın: Isı, 600; Hız, 50; Zaman, 75.

4. Hayvan Cerrahisi, DNA Enjeksiyonu ve Elektroporasyon

NOT: Bu adıma genel bir bakış Şekil 1'de açıklanmıştır. Sıçan yavruları için prosedür burada açıklanmış olsa da, yöntem aynı prosedürü kullanan daha olgun hayvanlara da uygulanabilir.

1. Oksijen akışını 0.4 L / dk'ya ve izofluran konsantrasyonunu% 4'e (hacim / hacim) ayarlayarak hayvan hareketsiz hale gelene kadar sıçanı indüksiyon kutusunda izofluran ile uyuşturun. Uygun anesteziyi doğrulamak için ayak parmağınızı kıstırma işlemi yapın.
2. Fareyi bir binoküler mikroskop altında önceden ısıtılmış ısıtıcıya koyun ve yüz maskesinden sürekli olarak izofluran uygulayarak anesteziyi sürdürün. Oksijen akışını 0,2 L/dk'ya ve izofluran konsantrasyonunu %2'ye (hacim/hacim) ayarlayın. Hayvanın gözleri açıksa gözlerin kuruluğunu önlemek için göz damlası kullanın.
3. Bacakları cerrahi bantla sabitleyin.
4. Arka uyluktaki cildi povidon-iyot ile temizleyin ve neşter
   NOT: Kılla kaplıysa cerrahi alanları tıraş edin.
5. Dikiş iğneleri ile kuadriseps femoris kası ile biseps femoris kası arasında bir açıklık oluşturarak siyatik siniri açığa çıkarın.
6. Siniri% 0.9 NaCl çözeltisi ile ıslatın. Tüy bırakmayan kağıtla fazla suyu emdirin.
7. Bir cam mikropipetin tabanını esnek bir boruya yerleştirin ve yeterli miktarda DNA solüsyonunu (en az bir mikrolitre) nazikçe aspire ederek mikropipete doldurun.
8. Bir iğne kullanarak sinirin distal tarafını nazikçe çekerek açıkta kalan siniri kaldırın.
   NOT: Mekanik stresi en aza indirmek için sinire gerginlik uygulamayın.
9. Cam mikropipeti sinirin distal bölgesine yerleştirin ve DNA solüsyonunu basınç uygulayarak (yani esnek tüpün açık ucuna üfleyerek) enjekte edin. Sinir yeşil görünene kadar (maksimum 1 μl) DNA solüsyonu enjekte edin. Mikropipetin sık sık takılması sinire zarar verebileceğinden, mikropipeti iki defadan fazla takmayın.
10. Sinirden yaklaşık 1-2 mm aralıklarla cımbız tipi bir platin elektrot yerleştirin. Elektrot ile sinir arasındaki boşluğu %0.9 NaCl solüsyonu ile doldurun.
    NOT: Sinir üzerinde mekanik stresi önlemek için siniri elektrotla tutmayın.
11. Elektrotlu bir elektroporatör kullanarak enjeksiyon bölgesine elektrik darbeleri uygulayın. İlk darbe setinden sonra elektrodu ters çevirin ve başka bir darbe seti uygulayın. Aşağıdaki parametreleri kullanın: voltaj, 50 V; nabız süresi, 5 msn; nabız aralığı, 100 msn; nabız numarası, 4 kez.
12. Elektroporasyon bölgesini %0.9 NaCl çözeltisi ile temizleyin.

5. Elektroporasyon sonrası

1. : Kesikleri siyanoakrilat yapıştırıcı ile kapatın.
2. Tutkalı kuruttuktan sonra, yarayı povidon-iyot ile temizleyin.
3. Yavruyu yüz maskesinden çıkarın. Anesteziden tamamen kurtulmasını sağlamak için yavruyu en az bir saat ısıtın.

Sonuçlar

Şekil 1: İn vivo Elektroporasyon Yönteminin şeması. İlk olarak, anestezi uygulanmış sıçanın siyatik siniri açığa çıkar. İkinci olarak, plazmit DNA'sı siyatik sinire enjekte edilir. Üçüncüsü, elektrik darbeleri forseps şeklindeki elektrot aracılığıyla enje...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Genopure plazmid Maxi kit	Roche	03 143 422 001	Plazmid DNA saflaştırma kiti
Fast Green CFC	WAKO	069-00032	DNA enjeksiyonu için boya
GC 150T-10	HARVARD APARATI	30-0062	Cam kılcal
Emme borusu	Drummond	05-2000-00	Mikro enjeksiyon için emme borusu
MODEL P-97	SUTTER INSTRUMENT CO.	Mikropipet çektirme
CUY21 Tek hücreli	BEX	Elektroporatör CUY21 Tek Hücreli	Darbe üreteci
Elektrikli ısıtıcı	KODEN	CAH-6A	Ameliyat sırasında ısıtıcı
Isofluolane	Mylan	1119701G1076	Anestezik