Sıçan Feokromasitoma 12 Hücrelerinde Gözenekli Bir Silikon Film Kullanılarak Sinir Büyüme Faktörünün Sürekli Verilmesi

Özet

Kaynak: Rosenberg, M., et al. Sinir büyüme faktörünün taşıyıcıları olarak gözenekli silikon filmlerin tasarlanması. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu video, PC12 hücre farklılaşmasını desteklemek için sinir büyüme faktörünün (NGF) sürekli salınımı için parçalanabilir bir nanoyapılı gözenekli silikon (PSi) filmin kullanımını göstermektedir. NGF, elektrostatik etkileşimler yoluyla filmin gözeneklerine adsorbe edilir ve difüzyon ve iskele bozulması yoluyla yavaş yavaş ortama salınır. Bu kontrollü uygulama, PC12 hücresinin sağkalımını destekler ve uzun bir süre boyunca nörit büyümesini ve dallanmasını kolaylaştırır.

Protokol

1. Oksitlenmiş gözenekli silikon (PSiO₂) Taşıyıcılarının İmalatı Bir

1. Silikon (Si) gofreti (tek tarafı <100> yüzünde cilalı ve ağır Bor katkılı, p-tipi, 0.95 mΩ ·cm) elmas uçlu bir kalem kullanarak 1,5 cm × 1,5 cm'lik numunelere kesin.
2. Si numunelerini ortam havasında 2 saat boyunca 400 °C'de bir tüp fırında oksitleyin (ısıtma hızı: 25 °C/dak, doğal soğutma).
3. Si örneklerini 5 dakika boyunca sulu hidroflorik asit (HF) (% 48), çift damıtılmış su (ddH₂O) ve etanol (% 99.9) (1: 1: 3 v / v / v) çözeltisine daldırın; daha sonra örnekleri üç kez etanol ile durulayın ve bir nitrojen akışı altında kurutun.
   NOT: HF camı çözdüğü için HF çözeltisini yalnızca plastik kaplarda hazırlayın ve saklayın.
   DİKKAT: HF oldukça aşındırıcı bir sıvıdır ve çok dikkatli kullanılmalıdır. Maruz kalma durumunda, suyla iyice durulayın ve etkilenen bölgeyi HF panzehir jeli ile tedavi edin; Derhal tıbbi yardım alın.
4. Si numunesini, geri temas olarak bir alüminyum folyo şeridi ve karşı elektrot olarak bir platin bobin kullanarak bir politetrafloroetilen aşındırma hücresine monte edin.
5. 250 mA /^cm2'lik sabit bir akım yoğunluğunda 30 saniye boyunca 3: 1 (h / h) sulu HF ve etanol (% 99.9) çözeltisinde bir kurban tabakası aşındırın; daha sonra elde edilen PSi filminin yüzeyini üç kez etanol ile durulayın ve bir nitrojen akışı altında kurutun.
6. Yeni kazınmış gözenekli tabakayı sulu bir sodyum hidroksit (NaOH) çözeltisi (0,1 M) içinde 2 dakika çözün. Daha sonra üç kez etanol ile durulayın ve bir nitrojen akışı altında kurutun.
7. Numuneyi 2 dakika boyunca sulu HF (%48), ddH₂O ve etanol (%99,9) (1:1:3 v/v) çözeltisine daldırın. Daha sonra üç kez etanol ile durulayın ve bir nitrojen akışı altında kurutun.
8. Si örneğini 3: 1 (h / v) sulu HF ve etanol (% 99.9) çözeltisinde 250 mA /^cm2 sabit akım yoğunluğunda 20 saniye boyunca elektrokimyasal olarak aşındırın; daha sonra elde edilen PSi filminin yüzeyini üç kez etanol ile durulayın ve bir nitrojen akışı altında kurutun.
9. Gözenekli bir SiO₂ (PSiO₂) iskelesi oluşturmak için taze kazınmış PSi numunelerini 800 °C'de bir tüp fırında ortam havasında 1 saat boyunca (ısıtma hızı: 25 °C/dak, doğal soğutma) termal olarak oksitleyin.
10. PSiO₂ örneklerini 1 dakika boyunca 4.000 rpm'de pozitif kalın bir fotorezist ile döndürün; daha sonra kaplanmış örnekleri 90 ° C'de 2 dakika pişirin (ısıtma hızı: 5 °C / dak, doğal soğutma).
11. PSiO₂ numunelerini bir kesme testeresi kullanarak 8 mm × 8 mm numunelere doğrayın.
12. Fotorezisti çıkarmak için, doğranmış numuneleri 3 saat boyunca asetonda bekletin; daha sonra etanol ile iyice durulayın ve bir nitrojen akışı altında kurutun.

2. PSiO_2'nin sinir büyüme faktörü (NGF) ile yüklenmesi

1. NGF yükleme solüsyonunu hazırlamak için, 20 μg murin β-NGF'yi 400 μL'lik 1: 1 (h / h) 0.01 M fosfat tamponlu salin (PBS) ve ddH₂O çözeltisinde çözün.
2. PSiO₂ numunesinin üzerine 52 μL yükleme solüsyonu ekleyin ve kapaklı bir kapta oda sıcaklığında (RT) 2 saat inkübe edin.
   NOT: İnkübasyon sırasında solüsyonun kurumasını önlemek için tabakta yüksek nem oranı koruyun.
3. PSiO₂ taşıyıcısı içindeki NGF içeriğinin daha sonra miktar tayini için çözeltiyi numunenin üzerinde toplayın.
   NOT: PSiO_2'ye NGF yüklemesi, amaçlanan kullanımdan hemen önce yapılmalıdır; proteinin kuruması ve denatürasyonu riski nedeniyle protokol burada duraklatılamaz.

3. NGF Yüklü PSiO₂ Taşıyıcılarının Varlığında Hücre Canlılığı ve Büyümesi

1. Sıçan feokromositoma (PC12) hücre kültürü
   1. Roselle Park Medical Institute (RPMI) ortamına %10 at serumu (HS), %5 fetal sığır serumu (FBS), %1 L-glutamin, %1 penisilin-streptomisin ve %0.2 amfoterisin ekleyerek temel büyüme ortamını hazırlayın.
   2. RPMI ortamına %1 HS, %1 L-glutamin, %1 penisilin-streptomisin ve %0.2 amfoterisin ekleyerek bir farklılaşma ortamı hazırlayın.
   3. 8 gün boyunca 10 mL bazik büyüme ortamı ile 75^cm2'lik bir kültür şişesinde hücre süspansiyonunu (10 6 hücre) büyütün; her 2 günde bir, şişeye 10 mL bazik büyüme ortamı ekleyin.
   4. Farklılaşmış bir PC12 hücre kültürü oluşturmak için, hücre süspansiyonunu bir santrifüj tüpüne aktarın; hücreleri 200 x g'de 8 dakika santrifüjleyin ve RT. Süpernatanı atın.
   5. Hücreleri 5 mL taze bazik büyüme ortamında askıya alın ve hücreleri 200 x g ve RT'de 5 dakika boyunca yeniden santrifüjleyin; süpernatanı atın ve hücre peletini 3 mL bazik büyüme ortamında yeniden süspanse edin.
   6. Hücre kümelerini ayırmak için, 23 G'lik bir şırınga kullanarak hücreleri on kez aspire edin.
   7. Bir hemositometre hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın ve farklılaşma ortamı varlığında kollajen tip I kaplı plakalar üzerinde 10⁴ hücre /^cm2 çalışma alanı oluşturun.
   8. 24 saat sonra, plaka başına taze murin β-NGF (50 ng/mL) veya NGF yüklü PSiO₂ taşıyıcısı ekleyin.
      >NOT: Daha yüksek NGF konsantrasyonları (>50 ng/mL), belirtilen konsantrasyon kadar kesin etkiye sahiptir.
   9. Farklılaştırma ortamını her 2 günde bir yenileyin.
   10. Hücre canlılığını değerlendirmek için, temsili zaman noktalarında canlılık gösterge çözeltisinin% 10'unu (h / h) ekleyin ve 37 ° C'de 5 saat inkübe edin; Bir spektrofotometre kullanarak 490 nm'de absorbansı ölçün.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Aseton	Gadot	830101375
Amfoterisin	Biyolojik Endüstriler	03-028-1B
Sulu HF (%48)	Merck	101513
AZ4533 fotorezist	Metal Kimya A.Ş.	AZ4533
BSA fraksiyonu v	MP biyomedikal	216006950
BSA çözeltisi (%10)	Biyolojik Endüstriler	03-010-1B
Kollajen tip l	Corning Inc.
Kollajenaz	Enco	LS004176
Kollajen kaplı plastik lameller	NUNC Thermanox	1059846
D- (+) - glikoz	Sigma-Aldrich Kimyasalları	G8170
Dispase-II	Sigma-Aldrich Kimyasalları	4942078001
Etanol mutlak (% 99.9)	Merck	818760
FBS	Biyolojik Endüstriler	04-121-1A
Guanidin-HCl	Sigma-Aldrich Kimyasalları	G7294
Jambonun F-12 besin karışımı	Thermo Scientific	11765054
HBSS	Thermo Scientific	14185-045
HEPES (1M)	Thermo Scientific	15630-056
HS	Biyolojik Endüstriler	04-124-1A
L-15 orta	Sigma-Aldrich Kimyasalları	L5520
Laminin	Termo Bilimsel	23017015
L-glutamin	Biyolojik Endüstriler	03-020-1A
Murin β-NGF	Peprotech	450-34-20
Normal eşek serum (NDS)	Sigma-Aldrich Kimyasalları	G9023
Papain	Sigma-Aldrich Kimyasalları	p-4762
PBS (pH 7.4)			10 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl ve 2.7 mM KCl'nin çift damıtılmış suda (ddH₂O, 18 MΩ·cm) çözülmesiyle hazırlanır.
PBS X10	Biyolojik Endüstriler	02-020-1A
PC12 hücre hattı	ATCC	CRL-1721
Penisilin-streptomisin	Biyolojik Endüstriler	03-032-1B
Poli-L-lizin	Sigma-Aldrich Kimyasalları	P4832
PrestoBlue reaktifi	Thermo Scientific	A13261
RPMI orta	Biyolojik Endüstriler	01-100-1A
Si gofret	Siltronix Corp.		Yüksek B katkılı, p-tipi, 0.00095 Ω-cm direnç, <100> yönelimli
Sodyum azid	Sigma-Aldrich Kimyasalları	S2002
Sodyum hidroksit (NaOH)	Sigma-Aldrich Kimyasalları	S8045
Tanik asit	Sigma-Aldrich Kimyasalları	403040
Triton X-100	Chem-Impex International Inc.	1279

354236