Fare Hipokampal Dilim Kültürlerinde Tek Hücreli Elektroporasyon Yoluyla Gen İfadesi

Özet

Kaynak: Keener, D. G., et al. Fare Hipokampal Uyarıcı ve Sınıfa Özgü İnhibitör Nöronların Farklı Organotipik Dilim Kültüründe Tek Hücreli Elektroporasyon. J. Vis. Uzm. (2020).

Bu video, fare hipokampal dilim kültürleri içindeki nöronlara plazmit DNA'yı sokmak için tek hücreli elektroporasyon sürecini göstermektedir. Prosedür, nöronal zarı geçici olarak geçirgen geçirgen hale getirmek ve gen transferini kolaylaştırmak için hassas pipet konumlandırma, basınç ayarlamaları ve elektroporasyon darbelerini içerir. Elektroporasyondan sonra, dilim, tanıtılan ilgilenilen genin ekspresyonunu sağlamak için inkübe edilir.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Dilim kültürü hazırlama

1. Her iki cinsiyetten doğum sonrası 6 ila 7 günlük fareleri kullanarak, daha önce açıklandığı gibi fare organotipik hipokampal dilim kültürlerini hazırlayın.
   1. Deiyonize suda (mM cinsinden) 238 sükroz, 2.5 KCl, 1 CaCl₂, 4 MgCl₂, 26 NaHCO₃, 1 NaH₂PO₄ ve 11 glikozdan oluşan organotipik dilim kültürü için diseksiyon ortamı hazırlayın, ardından %5 CO₂/%95 O₂ ile 7.4 pH değerine kadar gaz.
   2. Aşağıdakilerden oluşan organotipik dilim kültür ortamını hazırlayın: %78,8 (h/....

Sonuçlar

Şekil 1: İki temsili cam pipet görüntüsü. (A) Bu protokolde kullanılan daha düşük dirençli (6,5 MΩ) pipetleri ve (B) elektroporasyon protokolleri için tipik olan daha yüksek dirençli (10,4 MΩ) pipetleri görünt.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Plazmid hazırlama
Plazmid Saflaştırma Kiti	Qiagen	12362
Organotipik dilim kültürü hazırlama
6 Kuyulu Plakalar	GREINER BIO-ONE	657160
Dumont #5/45 Forseps	FST	# 5/45	Organotipik dilim kültürü hazırlama için açılı diseksiyon forseps
Şişe Filtre Ünitesi	Kırlangıç	SCHVU02RE	Kültür ortamının filtrelenmesi ve depolanması
İnkübatör	Bağlayıcı	BD C150-UL
McIlwain Doku Doğrayıcı	TED PELLA, INC.	10180	Organotipik dilim kültürü hazırlama için doku kıyıcı
Millicell Hücre Kültürü Uç, 30 mm	Kırlangıç	PIHP03050	Organotipik dilim kültürü ekleri
Ozmometre	Hassas Sistemleri	OSMETTE II
PTFE kaplı spatulalar	Cole-Parmer	SK-06369-11
Makas	FST	14958-09
Stereo Mikroskop	Olympus	SZ61
Steril Vakum Filtrasyon Sistemi	Milipore	SCGPT01RE	aCSF'nin
Elektrot hazırlama
Kılcal Camlar	Warner Instruments	640796
Mikropipetleyici Çektirme	Sutter Aleti	P-1000	Çektirme
Fırını Bağlayıcı		BD (E2)
Çektirme Filament	Sutter Aleti	FB330B	Çektirme
Tek hücreli elektroporasyon
3,5 mm Falcon Petri Çanak ÇİÇEKLER	BD Falcon	353001
Hava Masası	TMC	63-7512E Elektroporasyon
Sistemi	Moleküler Cihazlar	Axoporator 800A	Elektroporatör

filtrasyonu ve depolanması