Bir sıçan modelinde omurilik onarımı için kendi kendine birleşen peptitlerin ve nöral öncü hücrelerin enjekte edilmesi

Abstract

Kaynak: Zweckberger, K., et al. Deneysel Servikal Omurilik Yaralanmasında Nöral Öncü Hücrelerin ve Kendi Kendine Birleşen Peptitlerin Sinerjik Kullanımı. J. Vis. Uzm. (2015).

Bu protokol, bir sıçan modelinde omurilik yaralanması onarımı için hedefe yönelik bir enjeksiyon yaklaşımını göstermektedir. Destekleyici bir iskele oluşturmak için lezyon çekirdeğine kendiliğinden birleşen peptitlerin (SAP'ler) verilmesini ve ardından dokuyu yeniden şekillendirmek için lezyonun etrafına nöral öncü hücre (NPC) enjeksiyonlarını içerir.

Protocol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

Servikal Anevrizma Klipsi Kontüsyon/Kompresyon Modeli

1. Ameliyattan önce aletleri otoklavlayın ve tüm cerrahi işlem boyunca %70 alkol banyosuna koyarak steril tutun.
2. Wistar sıçanlarını (250-270 g) oksijen (O₂), azot oksit (N₂O) (1: 1) ve% 1.8-2.2 İzofluran kombinasyonu ile anestezi yapın ve bir gaz anestezi maskesi ile spontan solunumu destekleyin. Anestezi indüksiyonu için 1 dakika boyunca% 5 İzofluran ile başlayın ve daha sonra azaltın. Ameliyata başlamadan önce, ağrılı bir uyarı vererek (örneğin pençelerde) anestezi derinliğini kontrol edin. Kuruluğu önlemek ve sonraki enfeksiyonları önlemek için gözlere yağlı merhemler sürün.
3. Fareleri bir ısıtma yastığına (37 °C) koyun ve kafayı stereotaktik bir çerçeveye sabitleyin.
4. Servikal omurga çevresindeki cerrahi bölgeyi tıraş edin ve povidon-iyot ve% 70 alkol ile dezenfekte edin.
5. Servikal vertebradan (C2) omurganın üzerinde, torasik vertebral gövde 2'nin (T2) belirgin prosese ulaşan orta hat insizyonu yapın.
6. Vertebra kaslarının dış tabakasını doğrudan orta hatta (kanamayı önlemek için) kranio-kaudal yönde kesin ve processus spinosus ve laminalara ulaşana kadar daha derin kas tabakalarını künt olarak inceleyin. Ekartörleri yerleştirin.
7. Laminektomi için hedeflenen seviyeleri gözlemlemek için vertebral cisim T2'nin belirgin processus spinosusunu yönlendirin. Seçilen laminaların tanımlanması ve mikro-cerrahi hazırlığından sonra, laminaları ve processus spinosus'u gevşetmek için ligamenti flavalarını kesin. Son olarak, omuriliğin yanında bir kemik makası ile laminaları kesin ve omuriliğin kendisine herhangi bir baskı yapmasını önleyerek bunları nazikçe çıkarın.
   NOT: En yaygın seviyeler C5/6, C6/7 veya C7/T1'dir. Perioperatif mortalite oranı, yaralanma seviyesi ne kadar rostral olursa o kadar artar. Paravertebral venöz sinüsten kanama yaygındır ve bir süngerle dikkatli bir şekilde sıkıştırılarak tedavi edilebilir.
8. Kordonu travmatize etmek için klipsi yerleştirmeden önce, kırpılmalarını önlemek için ortaya çıkan sinir köklerini belirleyin (özellikle C5/6 seviyelerinde).
9. Düzgün klips indüksiyonunu sağlamak için, ventral durayı vertebral gövdelerin dorsal tarafından bir kanca ile gevşetin ve klips için bir koridor hazırlayın.
10. Son olarak, açık klipsi yerleştirin ve kontüzyon yaralanması elde etmek için yerine oturmasına izin verin (hızlı kapanma). Klip kapanma kuvveti ve klip kapanma süresi, travmanın yoğunluğunu ve kompresyonun derecesini belirler. Yaygın olarak kullanılan, 15-35 g arasında klips kuvvetleri ve örneğin 1 dakikalık bir kırpma süresidir (Şekil 1).
11. Klipsi çıkardıktan sonra, kasları 2 kat halinde yerleştirin ve yarayı kapatın.
12. Anesteziyi durdurun ve sternal yaslanma için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanın sürekli gözleminiz altında uyanmasına izin verin. Son olarak, fareyi tek bir kafese koyun ve ameliyat sonrası tedavi yönergelerini izleyin.
13. Hayvanlar bu tür yaralanmaların ciddiyeti ile mücadele ettiğinden, ameliyat sonrası tedavilere özellikle dikkat etmelisiniz:
    1. Ağrı kesiciler uygulayın (Buprenorfin ve Meloksikam, sırasıyla 3 gün ve 5 gün boyunca ve klinik semptomlara göre).
    2. 3 gün boyunca deri altından ek tuzlu su çözeltisi verin (günde 2 kez, 5-10 mililitre (ml)).
    3. Ameliyattan 2 gün önce ve ameliyattan 7 gün sonrasına kadar içme suyunda antibiyotik sağlayın (ör., Moksifloksasin)
    4. Mesane fonksiyonunun iyileşmesi sürekli olarak görünene kadar idrar kesesini günde 2-3 kez sıkın.
    5. Ameliyat edilen hayvanların nörolojik eksikliklerini ve fizyolojik durumlarını günde en az bir kez gözlemleyin.

2. SAP'lerin ve NPC'lerin enjekte edilmesi (yaralanmadan 14 gün sonra)

1. 1.1 ila 1.3'te tarif edildiği gibi anesteziyi indükleyin, sıçanın kafasını stereotaktik bir çerçeveye sabitleyin, dikişleri veya yara klipslerini çıkarın ve yarayı ve cerrahi alanı povidon-iyot ve% 70 alkol ile dezenfekte edin.
2. Paravertebral kasları dikkatlice inceleyin, ekartörleri yerleştirin, skar dokusunu duradan mikroskobik olarak çıkarın ve lezyon bölgesini yeniden ortaya çıkarın.
3. Hücre dışı bir matris jeli gerçekleştirmek için SAP'leri %1 (a/h) konsantrasyonda hazırlayın. QL6 SAP'ler fizyolojik olarak uyumlu bir pH'a sahiptir ve enjeksiyondan önce tamponlanmaları gerekmez. Omurilikteki SAP'lerin görselleştirilmesi için, QL6'nın (QL6-floresein izotiyosiyanat [FITC]) bir floresan türevi kullanın.
4. SAP'leri (5 mikrolitre (μl) lezyonun merkezine, her biri orta hattın iki taraflı olarak 2.5 μl olmak üzere 2 porsiyon halinde dağıtılan enjekte edin. Mikro cam kılcal damar (100 mikrometre (μm) dış çap [OD]) ile stereotaktik çerçeveye bağlı bir Hamilton şırınga kullanın. Durayı keskin bir iğnenin ucuyla dikkatlice açın ve cam kılcal damarı stereotaktik olarak travmatize omuriliğe 2 milimetre (mm) yerleştirin.
5. Hacmin 1 / 3'ünü enjekte ettikten sonra, iğneyi 1,5 mm derinliğe kadar ve 1/3 ila 1 mm daha sonra çıkarın. Tüm hacmin enjeksiyonundan sonra ve şırınganın çıkarılmasından önce, jel oluşumunu stabilize etmek için 5 dakika bekleyin.
6. NPC'ler oluşturmak için, yetişkin diskozom kırmızı floresan proteini (DsRed) fareleri (veya sarı floresan proteini [YFP]-pozitif fareler, yeşil) kullanın ve bunları paraventriküler bölgeden izole edin ve yetiştirin.
7. Hücre süspansiyonunda ~%90 canlı hücrelerin varlığını gösteren Tripan Mavisi boyama ile NPC'lerin canlılığını değerlendirin. Hücreleri bir büyüme ortamında (50 x 10³ canlı hücre / μl) seyreltin ve ardından hücre nakli için kullanın.
8. Yaralanma bölgesinin 2 mm rostral ve kaudalinde bilateral olarak dört adet 2 μl (8 μl toplam hacim, 4 x 10⁵ NPC içeren) intraspinal enjeksiyon yapın. Durayı açtıktan sonra, Hamilton mikro cam kılcal damarı omuriliğin dorsal yüzeyinin 1,5 mm altına yerleştirin ve 2 μl hücre süspansiyonu enjekte edin. Yaklaşık 0,5 μl / dak (dak) bir enjeksiyon hızı seçin.
9. Her enjeksiyonun sonunda ve kılcal damarın kordondan çıkarılmasından önce, en az 1 dakika bekleyin, böylece doku gerilmesinin yeni hücre hacmine uyum sağlamasına izin verin. (Şekil 2)

Results

Şekil 1: Klip kontüzyonu/kompresyon anevrizması modeli. (Bir) C7 / T1 laminektomi sonrası cerrahi mikroskop ile fotoğraf çekin ve bir sıçanın omuriliğinin kontüzyonunu / kompresyonunu klipleyin. (B) Hassas ka...

Materials