Farelerde Uykudan Uutanlığa Geçiş için Nöral Devrelerin Optogenetik Manipülasyonu

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Hayvan Cerrahisi, Virüs Enjeksiyonu, EEG / EMG için Elektrot ve Fiber Optik İmplantasyon

DİKKAT: Kullanılacak virüsün biyogüvenlik seviyesine göre uygun koruma ve taşıma teknikleri seçilmelidir. Adeno-ilişkili virüs (AAV), enjeksiyon için izole edilmiş bir P1A dereceli odada kullanılmalı ve AAV taşıyan tüp, tüm hacim tükendikten sonra bir otoklav ile sterilize edilmelidir. Cerrahi bölge ve implante edilen tüm materyaller kullanım sırasında temiz ve steril olmalıdır.

NOT: Şekil 1'e bakın.

1. Cerrahi ekipmanı otoklav ile dezenfekte edin.

2. Anestezik bir buharlaştırıcı kullanarak fareleri izofluran ile uyuşturun. Fare, kuyruğu forseps ile sıkıştırmaya yanıt kaybıyla belirlenen istenen anestezi derinliğine ulaşana kadar gözlemleyin. Kurumasını önlemek için gözlere oftalmik merhem sürün.

3. Cerrahi alanı iyot çözeltisi veya% 70 etanol (EtOH, 3x) ile dezenfekte edin ve yeterince kurulayın. Ameliyat yapılırken virüsün buz üzerinde çözülmesine izin verin. Cerrahi alanı emici laboratuvar tezgah kağıdı ile örtün.

4. Farenin kafasını kulak çubukları ve bir burun kıstırma ile stereotaktik aparata sabitleyin. Başın sabit bir şekilde tutulduğunu onayladıktan sonra, bregma ve lambda pozisyonlarının yatay bir çizgi üzerinde aynı seviyede olduğundan emin olmak için kafa derisinde orta sagital bir kesi yapın.

5. Konumlandırma boşluğunu önlemek için, burun sıkışma ve kulak çubuklarının seviyelerini yukarı ve aşağı uygun şekilde ayarlayın. Bregma ve lambda, sırasıyla sutura saggitalis ve sutura coronalis veya sutura lambdoidal arasındaki kesişimi ifade eder (Şekil 2).

6. Kafatasına erişimi sürdürmek için cildi tutmak için Serafin kelepçeleri kullanın. Kafatası maruz kaldıktan sonra, bregma ve lambda dahil olmak üzere kraniyal sütürlerin daha net görüntülenmesini sağlamak için kafatasının yüzeyini iyot veya% 5 H₂O₂ ile dezenfekte edin.

7. AAV vektör enjeksiyonunu hazırlayın:

1. 10 mL'lik bir şırınganın içini (Malzeme Tablosuna bakınız) sırayla %70 EtOH, %100 EtOH ve sterilize su ile 5 kez yıkayın. Şırıngayı bir mikroenjeksiyon pompası kolunun kelepçesine sabitleyin ve şırıngadaki tüm çözeltinin boşaltıldığından emin olun.

2. 2 μL mineral yağı hava kabarcıkları olmadan dikkatlice aspire edin, ardından virüs çözeltisinin belirtilen hacmini aspire edin. Aspirasyondan sonra, piston düğmesini manipüle edin ve virüs çözeltisinin iğnenin ucunda ortaya çıktığını onaylayın.

NOT: Virüs çözeltisinin enjeksiyon hacmi, aynı fare suşu ve aynı virüs ürünü kullanılarak yapılan pilot deneylerde belirlenmiştir. Virüs çözeltisinin hacmi ile enfeksiyon alanının kapsamı arasındaki ilişki önceden tahmin edilmelidir.

8. AAV vektörü:

1 enjekte edin. Mikroenjeksiyon iğnesinin ucunu bregma üzerine ayarlayın ve koordinatları orijinal nokta olarak not edin. Ucu belirlenen enjeksiyon bölgesine getirin (BNST için: anteroposterior + 0.2 mm, mediolateral ± 1.0 mm, dorsoventral - 4.2 mm) ve iğnenin ucunu konumuna yerleştirin. Kafatasına bir işaret koyun ve 0,7 mm karbür kesicili bir diş matkabı kullanarak yaklaşık 2 mm çapında delikler açın. Dura veya beyin dokusuna zarar vermemeye dikkat edin.

2. Deliklerin etrafındaki kanı pamuklu çubukla aldıktan sonra, iğneyi yavaşça BNST konumuna getirin. Belirtilen miktarda virüs solüsyonunu (0,07 μl/dk) mekanik bir mikroenjektör ile yavaşça enjekte edin. Enjeksiyonu tamamladıktan sonra, solüsyonun BNST dokusuna yeterince sızmasını sağlamak için iğneyi 5 dakika bekletin. İğneyi dikkatlice çıkarın.

3. Bilateral enjeksiyonlar için, diğer taraftaki 1.8.1-1.8.2 adımlarını tekrarlayın. İşlem boyunca kafatasını nemli tutmak için steril salin uygulayın.

NOT: Dört EEG elektrotu (4 mm), iki EMG elektrotu (2 mm; 4 mm'lik elektrodu pense ile 2 mm'ye kesin) ve 6 elektrotlu (Şekil 2A) özel elektroensefalografi (EEG)/elektromiyografi (EMG) implantları (Genişlik: 5 mm, derinlik: 7 mm, yükseklik: 1 mm) kullandık (Şekil 2A).

9. EMG elektrotlarına her iki ucundan 1 mm'lik yalıtımın sıyrıldığı iki paslanmaz çelik teli (Malzeme Tablosuna bakınız) lehimleyin. Elektrotların merkezini bregmaya ayarlayın, her EEG elektrodunun konumunu işaretleyin (ön-arka ± 1.5 mm, mediolateral ± 1.0 mm) ve implantın konumunu belirleyin (Şekil 2B).

10. Optik fiberleri implante edin:

1. Manipülatöre bir optik fiber yüksük takın ve manipülatör kolunu yatay bir çizgiye karşı ±30°'lik bir açıya sahip olacak şekilde döndürün (bu işlem yalnızca BNST stimülasyonu durumunda olduğu gibi elektrotlar ve optik fiberler arasındaki paraziti önlemek için gereklidir). Fiber ucunu bregma üzerine koyun ve koordinatları kaydedin.

2. Ucu hedeflenen yerleştirme çizgisine getirin ve kafatasındaki konumu işaretleyin. Ayrıca, ankraj vidaları için yerleştirme yerinin yakınına ek işaretler koyun. Optik fiberi yerleştirmek ve vidayı sabitlemek için kafatasını her bölgede bir diş matkabı ile delin. Vidayı kafatasına sabitleyin. Vidayı kırmamaya veya herhangi bir dokuya zarar vermemeye dikkat edin.

3. Optik fiberi bir manipülatör ile BNST'nin üzerine ulaşana kadar nazikçe yerleştirin. Yüksük, kalan kafatası üzerinde durmalıdır (Şekil 1B).

4. Elyafı ve vidayı kaplamak için ışıkla sertleştirilebilir diş çimentosu (Malzeme Tablosuna bakın) uygulayın. Yapıştırıcıyı katılaştırmak için reaksiyon süresi, üreticinin el kitabı tarafından belirtilmelidir (Malzememizin, belirli dalga boylu foto jeneratörlerle en az 10 saniye ışığa maruz kalması gerekir. Bundan sonra tutkalı kurutmak gereksizdir).

5. Bu adımda, elektrotlar için montaj alanını hiçbir malzemenin (vida veya yapıştırıcı) işgal etmediğinden emin olun. Ek olarak, optik fibere ve kabloya bağlanan yüksük için çimentoda herhangi bir kesinti yapmaktan kaçının. Bilateral stimülasyon için karşı taraftaki 1.10.1-1.10.4 adımlarını tekrarlayın.

11. EEG / EMG elektrotları için delikler açın. Elektrotların uçlarını deliklere yerleştirin. İmplantı tutun ve kafatası ile elektrotlar arasındaki boşluğa siyanoakrilat yapıştırıcı uygulayın. Herhangi bir malzemeye müdahale etmemeye dikkat ederek tekrar yerleştirin.

12. Elektrotların ve optik fiberlerin çevresini siyanoakrilat yapıştırıcı ile kaplayın, ardından yapıştırıcı üzerine siyanoakrilat hızlandırıcı uygulayın. Bu adım, yüksük-optik kablo ve elektrot-kurşun tel bağlantı bölgesinde herhangi bir kesintiye neden olmayı önler (Şekil 1C).

NOT: Siyanoakrilat yapıştırıcı ve hızlandırıcısı fare gözü için zararlıdır. Bu kimyasal maddelerin dökülmesine neden olmamaya dikkat edin. Ayrıca, yapıştırıcı katılaşmasından hemen sonra beklenmedik sapmaları önlemek için elektrotlara ve liflere güçlü bir şekilde dokunmamaya dikkat edin.

13. Fare boyun kaslarını açığa çıkarın ve EMG elektrodu için telleri kasın altına yerleştirin. EMG elektrodunun uzunluğunu, ense kaslarının hemen altına yerleştirilecek şekilde ayarlayın. EMG sinyalini yakalamak için elektrodun ucu ile kas fasyası arasında hafif bir bağlantı yeterlidir.

14. İmplantları doldurmak için siyanoakrilat yapıştırıcı uygulayın ve yapıştırıcıyı hızlandırma sıvısı ile katılaştırın. Ardından, postüral refleks görünene kadar fareyi kurtarma için bir ısıtma yastığının üzerine koyun. Isıtma yastığı sıcaklığını hayvan dinlenme vücut sıcaklığına ayarlayın (C57BL6 farelerinde ZT 0-12'de 36.0 °C; 38.0 °C'yi aşmayın).

NOT: Steril cerrahi için antibiyotik gerekmemektedir. Ameliyat sonrası analjezi için yerel kurumsal yönergelerinizi izleyin. Fareleri en az 7 günlük bir iyileşme süresi boyunca bir ev kafesinde tutun.

2. Belirli Uyku Durumlarında Hedeflenen Nöronların Foto-uyarımı ile EEG / EMG İzleme

DİKKAT: Bu protokol, 3B sınıfı lazer ekipmanının veya LED cihazlarının kullanımını içerir. Deneyciler güvenlik bilgilerinin farkında olmalıdır. Koruyucu gözlük gereklidir.

1. Lazer kablosunu optik fibere bağlamadan önce, lazer yoğunluğunu bir ölçekleyici ile ayarlayın. Lazer kablosunun ucunu bir yüksük ile kullanılmayan bir optik fibere bağlayın ve fiber ile kablo arasındaki bağlantı noktasında boşluk olmadığını onaylayın.

2. Lazerin ana şalterini açın ve ısınması için 20 dakika bekleyin.

3. Lazeri yoğunluk kontrol cihazına yayın ve lazer yoğunluğunu 10 mW / mm'ye ayarlayın². Lazer modunu transistör mantığına değiştirin ve süre için 10 ms, dinlenme için 40 ms, döngü için 20 kez ve 20 kez tekrar olarak ayarlanan model regülatörü tarafından kontrol edilen fiberden ışık darbelerinin yayıldığını onaylayın (yani, 20 s boyunca 10 ms ışık darbesinin 20 Hz'i).

4. İyileşme süresinden sonra, fareleri EEG / EMG kaydetmek için deney odasına taşıyın. Ev fareleri, yiyecek ve su ad libitum ile 12 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsü ile sabit 23 ° C'de tutuldu.

5. Dolaşmayı önlemek için implante edilmiş elektrodu ve bir kayma halkasına bağlı kablo adaptörünü bağlayın. Lazer sızıntısını önlemek için bağlantı yerinin alüminyum folyo gibi ışık geçirmeyen malzeme ile kapatılması tavsiye edilir. İki taraflı bir deney gerekiyorsa, kablolar için çatallı bağlantılı bir kayma halkası kullanın.

6. Bu protokolde, hızlı göz hareketi olmayan (NREM) uykudan veya hızlı göz hareketi (REM) uykusundan uyanıklığa kadar olan gecikmeyi değerlendiriyoruz, bu nedenle kayıt süresi optimize edilmiş zeitgeber süresinde sınırlandırılmalıdır (ZT0, ışığın açık olduğu zaman olarak tanımlanır). Bu protokol ZT4 - ZT10 arasında gerçekleştirilmiştir. İklimlendirme olarak farelerin deney odasında en az 1 saat serbestçe kalmasına izin verin.

7. Deney süresi boyunca, EEG ve EMG sinyallerini aynı monitörde izleyin ve farenin durumunu uyanıklık, NREM uykusu veya REM uykusu olarak değerlendirin. Her durumu ayırt etmeyi kolaylaştırmak için her dalga için kazanç kontrolünü kullanın.

8. NREM uykusundan uyanıklık gecikmesine kadar olan gecikmeyi ölçmek için, 40 saniye boyunca stabil NREM uykusunu veya 30 s boyunca stabil REM uykusunu gözlemleyin, ardından fotostimülasyon için model üretecinin anahtarını açın (bu protokol 20 s boyunca 20 Hz 10 ms ışık darbesi üretir). İmplante edilmiş optik fiberlere lazer emisyonunu onaylayın.

9. Uyku durumu uyanıklığa geçene kadar EEG / EMG sinyallerini kaydedin. İki veya daha fazla deneysel denemeye ihtiyaç duyulursa, optogenetik manipülasyonu günde bir kez ile sınırlayın çünkü fotostimülasyon uyku / uyanıklık mimarisini etkileyebilecek yapay bir müdahaledir.

10. Deneyden sonra, immünohistokimyasal analiz için tüm beyni örneklemek için steril salin ve paraformaldehit (PFA) ile derinlemesine anestezi yapın ve perfüze edin.

Şekil 1: AAV, implant optik fiberleri ve EEG/EMG implantlarını enjekte etme prosedürü. (A) Virüs enjeksiyonunun deneysel prosedürü. Transkripsiyonu Cre rekombinaz tarafından aktive edilen bir AAV vektörüne dahil edilen EYFP ile kaynaşmış ChR2 veya EYFP (kontrol için) geni, BNST'ye bilateral olarak enjekte edildi. (B) Optik fiberler, elektrotla çarpışmayı önlemek için yataya 30°'lik bir açıyla BNST'ye doğru yerleştirildi. Etrafına iki vida yerleştirildi. (C) Optik fiberlerin güvenli bir şekilde yerleştirilmesinden sonra bir EEG / EMG kayıt cihazı implante edildi. (D) Ameliyat sonunda tüm cerrahi alan siyanoakrilat yapıştırıcı ile kaplanmalı ve sağlam bir şekilde sabitlenmelidir. Elektrot ve yüksükleri birbirine bağlayan bölgeye herhangi bir ajan uygulamadığınızdan emin olun.

Şekil 2: Özel EEG/EMG elektrot ve elektrot pimleri yerleştirme yerleri. (Bir) Üst: 6 elektrot piminden dıştaki iki pim 2 mm'ye kadar kesilir. Alt: EEG/EMG elektrotları. (B) Bu elektrotlar ve EMG iletim telleri daha sonra lehimlenir. Bağlantı bölgesi, siyanoakrilat yapıştırıcı gibi herhangi bir yalıtımla izole edilmelidir. Elektrotların yerleştirme yerleri bregmaya göredir (anteroposterior ± 1.5 mm, mediolateral ± 1.0 mm). EMG telleri, boyun kasının altına, giriş yerindeki teli koruyan izolasyonun çıkarılmasıyla (1 mm) yerleştirilir.