Sıçanlarda Kronik İmplante Edilmiş Periferik Sinir Manşet Elektrotları ile Vagus Sinir Stimülasyonu

Özet

Kaynak: Sanchez, C. A., et al. Sıçanlarda kronik implantasyon için periferik sinir stimülasyon elektrotlarının hazırlanması. J. Vis. Uzm. (2020).

Bu video, uyanık bir sıçanda vagus sinir stimülasyonunu göstermektedir. İmplante edilmiş bir kronik periferik sinir manşet elektroduna sahip ve bir kol presleme görevinde eğitilmiş bir sıçan, implante edilmiş bir kafa başlığı aracılığıyla bir uyaran üretecine bağlanır. Vagus siniri, her başarılı kol basışından hemen sonra uyarılır ve bu da motor haritasının genişlemesine neden olur.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Manşet elektrot imalatını uyarma

1. Manşet hortumunu hazırlayın.
   1. Bir tıraş bıçağı kullanarak, 2,5 mm uzunluğunda bir polimer boru parçası kesin. Forseps uçlarını veya bir ataşı borunun içinden geçirin ve manşetin bir tarafındaki borunun duvarından uzunlamasına bir yarık açmak için bıçağı kullanın.
   2. Forsepsleri borudan çıkarın ve manşetin orta hattından uzun eksene dik olarak büyük bir dikiş iğnesi sokun. İğneyi yarıktan (üstte) ve karşıdaki borunun ortasına (altta) sokun. Kalan montaj adımları sırasında manşeti yerine sabitlemek için iğneyi köpük levhaya yerleştirin.
2. İmplantasyon sırasında manşet kapanmasını sabitlemek için bir dikiş yerleştirin.
   1. Küçük dikiş iğnesini manşetin duvarından, orta çizgiden, bir taraftaki üst yarıktan yaklaşık 0,5 mm uzağa sokun. Manşet borusuna zarar vermemek için iğneyi içeriden dışarıya doğru sokun. İğnenin deliğinden 2 cm uzunluğunda 6/0 sütür yerleştirin ve dikişi manşete geçirmek için iğneyi borunun duvarından çekin.
   2. İpliği yerinde bırakarak, iğneyi çıkarın ve manşetin orta hattı boyunca, ilk deliğin yaklaşık 0,5 mm altında boru duvarından ikinci bir delik açın. Sütürü iğnenin deliğinden geçirin ve dikişi tekrar manşetten geçirmek için iğneyi boru duvarından çekin.
   3. Dikiş ipliğinin her iki ucu da artık manşetin dış tarafında olmalıdır. Sütürü, üst delikten ~ 1,5 cm ve alt delikten ~ 0,5 mm uzanacak şekilde ayarlayın.
   4. Alt delikten uzanan dikişin kısa ucuna az miktarda UV (Ultraviyole) kürleme yapıştırıcısı uygulayın ve daha uzun dikiş ucunu, alt kuyruk borunun dış duvarı ile neredeyse aynı hizaya gelene kadar çekin. Yapıştırıcıyı sertleştirmek için UV çubuğunu kullanın ve dikişi sıkıca yerinde tutun.
   5. Manşetin karşı tarafında 1.2.1 ile 1.2.3 arasındaki adımları tekrarlayın.
3. Platin:İridyum (Pt:Ir) kablo uçlarını yerleştirin.
   1. Manşet duvarında 4 delik açmak için küçük dikiş iğnesini kullanın. Her bir delik çifti, manşetin her iki yanında üst yarıktan yaklaşık 0,5-0,8 mm uzakta olacak şekilde, dik orta hattan yaklaşık 0,5-0,8 mm uzağa yerleştirilmelidir.
      DİKKAT: Uçların en tutarlı ve doğru şekilde yerleştirilmesi için, tüm delikleri açmak üzere iğneyi içten dışa doğru sokun, Sütür yerleşimini kılavuz olarak kullanmak.
   2. Dikiş iğnesini tekrar yerleştirin, bu sefer kurşun delikten 1 dışarıdan içeriye doğru çalışın. 7,5 cm uzunluğunda 7,5 cm uzunluğunda Pt:Ir telinin yaklaşık 0,5 cm'sini iğnenin deliğinden geçirin ve tel ucunu manşet duvarından geçirmek için iğneyi borudan çekin. Teli, manşetin dış tarafında ~4.5 cm uzanacak şekilde ayarlayın (Şekil 1A).
   3. İğneyi tekrar kurşun deliğinden 1 geçirin, yine dıştan içe doğru çalışın ve ayrıca iğneyi kurşun delikten 2 doğrudan kurşun deliğin 1'in karşısına sokun. Pt:Ir telinin kısa (iç) ucunun ~0.5 cm'sini iğnenin deliğinden geçirin ve tel ucunu manşet duvarlarından geçirmek için iğneyi borudan çekin.
      NOT: Pt:Ir telinin her iki ucu da artık manşetin dış tarafında olmalı ve yarık kenarı etrafında ve kurşun delikten 1 bir tel halka oluşturulmalıdır (Şekil 1B).
   4. Pt:Ir kablosunu 1.3.1 ve 1.3.3 numaralı kurşun deliklerden geçirmek için 3 ila 4 arasındaki adımları tekrarlayın.
   5. Bir bütan çakmak kullanarak, kurşun delik 2 ve kurşun delik 4.DİKKAT: Manşete zarar vermemek için uçların uçlarını manşet tertibatının geri kalanından dikkatlice izole edin. Yaralanmayı önlemek için telleri tutmak için aletler kullanın.
   6. Uçları son konumlarına yerleştirmek için çıplak teli manşetin içine hizalayın. Bunu yapmak için, tel 1'den uzanan Pt:Ir telinin ucunu, telin yalıtılmamış kısmı delik 1 ile aynı hizaya gelene kadar yavaşça çekin. 3 ve 4 numaralı kurşun deliklerinden geçirilen telin yalıtımsız ucunu hizalamak için diğer uçla tekrarlayın.
   7. Manşetin dış tarafındaki kurşun delikler 1 ve 3'teki tel halkalara az miktarda UV ile kürlenen yapıştırıcı sürün. Yapıştırıcıyı sertleştirmek ve uçları yerine sabitlemek için UV çubuğunu kullanın.
   8. Yalıtılmamış Pt:Ir tel uçlarını manşetin iç duvarına doğru itmek için küçük bir pipet ucu kullanın. Uçlar yerleştirildikten sonra, 2 ve 4 numaralı kurşun deliklerinden uzanan tellerin uçlarını, yaklaşık 1 mm tel manşet duvarının dışından dışarı çıkacak şekilde kesin.
   9. Telin 1 mm'lik uçlarını manşetin dış yüzeyine doğru düz bir şekilde katlayın ve birlikte kısaltmamaya dikkat edin. Sadece iki kuyruğu kaplamak için az miktarda UV kürlü yapıştırıcı uygulayın ve kurşun yerleşimini sabitlemek ve elektrik yalıtımı sağlamak için yapıştırıcıyı sertleştirin.
      DİKKAT: Telleri yalıtmak ve hedef dışı stimülasyonu önlemek için dışarıdan açıkta kalan Pt:Ir yüzeylerini yapıştırıcı ile tamamen kaplamak önemlidir.
4. Pt:Ir kablo uçlarını sütür emniyeti ile yerine sabitleyin.
   1. Manşet tertibatlı büyük iğneyi köpük levhadan çıkarın. İğnenin deliğinden 3 cm uzunluğunda 6/0 sütür yerleştirin ve dikişi orta noktada manşetin altından geçirmek için iğneyi borudan çekin.
   2. Pt:Ir kurşun emniyeti için dikiş geçirme işlemini tamamlamak için küçük dikiş iğnesine geçin. Borunun ve tel uçlarının deformasyonunu önlemek için tekrar içten dışa doğru çalışarak iğneyi aynı orta hat deliğinden geçirin. Sütürün dış kuyruğunu iğnenin deliğinden geçirin ve manşetin kenarında bir dikiş halkası oluşturmak için iğneyi manşet duvarından çekin (Şekil 1C).
      NOT: Forseps kullanın ve sütürün manşetin uzun ekseni boyunca yönlendirildiğinden ve boruya karşı düz durduğundan emin olmak için mikroskop altında çalışın. Bu adım, uçların manşetin iç tarafında ayrı kalmasını ve manşet orta hattının yanlarında yerinde tutulmasını sağlar.
   3. Manşetin dış tarafında, dikişin uçlarını yarım düğüm halinde bağlayarak manşetin karşı ucunun etrafında ikinci bir halka oluşturun. Dikişin manşetin uzun ekseni boyunca uzandığından ve boruya karşı düz durduğundan emin olun. Düğümü boruya düz bir şekilde oturacak şekilde sıkı tutarken, yarım düğüme az miktarda UV kürleme yapıştırıcısı uygulayın ve yerinde tutmak için sertleştirin.
   4. Dikiş ipliğinin uçlarını düğüme mümkün olduğunca yakın dikkatlice kesin. Gerekirse, sütürün kısa uçlarını boruya düz bir şekilde dayanacak şekilde yapıştırmak için az miktarda ek UV kürleme yapıştırıcısı kullanın (Şekil 1D).
5. Konektör pimlerini Pt:Ir kablo uçlarına lehimleyin.
   1. Bir bütan çakmak kullanarak, Pt:Ir kablo uçlarının her birinin sonundaki ~3 mm'lik yalıtımı çıkarın. Altın bir pimin fincan tarafını (Malzeme Tablosuna bakın) her bir ucun yalıtımsız ucuna lehimleyin.
6. Monte edilen cihazın empedansını test edin.
   1. Altın pimleri bir LCR (Endüktans (L), Kapasitans (C) ve Direnç (R)) ölçerin veya elektrot empedans kontrol modülünün girişlerine bağlayın ve test frekansını 1 kHz'e ayarlayın. Manşet hortumunu (ve manşetin iç kısmındaki Pt:Ir stimülasyon kontaklarını) tuzlu suyla doldurulmuş küçük bir behere daldırın, altın kurşun pimleri ve prob konektörlerini kuru tutmaya dikkat edin. İmplantasyona devam etmeden önce monte edilmiş manşetin 1 kHz'de 2 kΩ'dan daha düşük bir empedansa sahip olduğunu doğrulayın.
      NOT: Yüksek empedans genellikle yetersiz Pt:Ir yüzey alanının açığa çıktığını gösterir, bu da yalıtımın yetersiz çıkarılması, manşetin iç kısmına yanlışlıkla yapıştırıcı uygulanması, kırık tel teller gibi faktörler nedeniyle ortaya çıkabilir, ve saire. Manşetler ayrıca, uzun süreli kullanımda kısa süreli kontaklara neden olabilecek kırık veya kötü yerleştirilmiş tel telleri açısından da incelenmelidir.

2. Başlık yapısı

NOT: Başlık takma prosedürleri daha önce yayınlananlara benzer ve kolaylık sağlamak için burada özetlenmiştir.

1. Başlığı birleştirin
   1. biri ~13 mm uzunluğunda ve diğeri ~10 mm uzunluğunda iki küçük parça 30 AWG (American Wire Gauge) tel sargı kesin. Her iki kablonun her iki ucundaki ~1.5 mm'lik yalıtımı sıyırın. Altın bir pimin pim tarafını, her telin bir ucuna, bardağa mümkün olduğunca yakın olacak şekilde lehimleyin. Lehim bağlantısının ötesindeki fazla pim uzunluğunu kesmek için tel kesiciler kullanın.
   2. AWG kablolarının diğer uçlarını 4 pinli bir mikroşerit konektörünün iki merkezi lehim kabına lehimleyin.
   3. Kablo başlık uçlarını konektöre doğru bükün ve altın pimleri Şekil 2A'da gösterildiği gibi birbirine paralel olarak konektöre düz bir şekilde yerleştirin. Daha kısa kabloya bağlı pim, daha uzun kabloya bağlı pimin altına yerleştirilmelidir. Başlık uçlarını yerine sabitlemek için tırnak akriliği, diş çimentosu veya UV ile kürlenen yapıştırıcı kullanın.

3. Cihaz kullanımı

1. Kronik vagus sinir stimülasyonu için manşet elektrotlarını implante edin.
   NOT: Tüm cerrahi prosedürler, NIH (Ulusal Sağlık Enstitüleri) Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak ve yerel IACUC (Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi) onayı ile uygun anestezi altında steril veya aseptik teknik kullanılarak yapılmalıdır. Aşağıdaki yordamlar, cihazın temsili bir kullanımını göstermek içindir ve kapsamlı olması amaçlanmamıştır.
   1. Fareyi stereotaksik bir çerçeveye yerleştirin ve başlık başlığının/konektörün implantasyonu için kafatası yüzeyini ortaya çıkarmak için parietal ve oksipital kemikler üzerinde sagital bir kesi yapın. Kafatasına dikkatlice 4 delik açın ve kuyumcu vidalarını yerleştirin. Kafa kapağını kafatasına ve vidalara sabitlemek için diş akrilik kullanın.
   2. Fareyi stereotaksik çerçeveden çıkarın ve sağ tarafına yerleştirin. Boynun sol tarafındaki deride dikey bir kesi yapın ve sol vagus sinirini sternomastoid ve sternohyoid kaslar arasında ve omohyoid kasın altında bulunan karotis arterden dikkatlice inceleyin.
   3. Manşeti deri altından kafatasına doğru tünelleyin. Altın pimleri kullanarak uçları başlık başlığına bağlayın.
   4. Vagus sinirini manşetin içine yerleştirin ve manşet dikişlerine çift düğüm atarak cihazı kapatın. İmplantasyon sırasında siniri künt, iletken olmayan kancalarla manipüle ederek veya siniri çevreleyen bağ dokusunu kavrayarak sinire zarar vermemeye dikkat edin.
   5. Cihaza stimülasyon uygulayarak implantı test edin (10 sn 0,8 mA treni, 30 Hz, 100 μs bifazik darbeler). Uygun implantasyon, solunumun durmasına ve SpO_2'de (Periferik Kılcal Oksijen Doygunluğu) %5 veya daha fazla bir düşüşe neden olacaktır.
   6. Altın pimleri ve açıkta kalan uçları diş akrilik ile örtün, yaraları dikişlerle kapatın ve kesi yerlerini tuzlu su, alkol ve povidon-iyot solüsyonu ile temizleyin.
   7. NIH yönergeleri ve IACUC onayı doğrultusunda yedek sıvılar, analjezikler ve ameliyat sonrası bakım sağlayın.
2. Uyanık davranış sırasında vagus sinirini uyarın.
   NOT: Hayvanlar belirli motor görevleri yerine getirirken VNS'nin (Vagus Sinir Stimülasyonu) verilmesinin, görevle ilgili kas sisteminin motor harita temsilini genişlettiği daha önce gösterilmiştir. Bu doğrulanmış paradigmayı, cihaz kullanımının temsili bir örneğini sağlamak için kullanıyoruz, ancak diğer birçok davranışsal paradigma ve/veya stimülasyon parametresi alternatif uygulamalarla ilgili olabilir. Sıçanlar, cihaz implantasyonundan önce burada kullanılan kol presleme görevinde yetkin olacak şekilde eğitildi. Ameliyat sonrası, VNS doğumundan önce iyi performans tekrar doğrulandı: sıçanlar günde 30 dakikalık iki eğitim seansında en az 100 başarılı deneme gerçekleştirdi. VNS, 5 gün boyunca takip eden 10 eğitim seansı sırasında doğru kol presleri ile eşleştirildi.
   1. Fareyi implante edilmiş kafa kapağı aracılığıyla bir uyaran üretecine bağlayın ve uygun stimülasyon ayarlarına ayarlayın. Motor kortikal haritanın VNS kaynaklı yeniden düzenlenmesi için, her bir doğru kol presini, her biri 100 μs genişliğe ve 800 μA genliğe sahip, 30 Hz frekansında iletilen 15 bifazik darbeden oluşan tek bir trenle eşleştirin.
   2. 30 dakikalık on egzersiz seansı boyunca her başarılı kol presinin algılanmasından hemen sonra bir stimülasyon treni verilir. VNS iletimi sırasında, akım stimülasyonunun başarılı bir şekilde iletilmesini izlemek için bir osiloskop kullanın.
3. Kronik olarak implante edilmiş manşet fonksiyonunu doğrulayın.
   1. Son VNS eşleştirilmiş eğitim seansından sonraki 24 saat içinde, motor korteksteki fonksiyonel somatotopik haritayı ölçmek için intrakraniyal mikrostimülasyon (ICMS) kullanın.
   2. Motor korteksin ICMS haritalaması için anestezi indüksiyonundan sonra, 10 saniyelik bir 30 Hz treni, 0.8 mA akım stimülasyonu (100 μs bifazik darbeler) uygulayarak manşet fonksiyonunu tekrar doğrulayın, bu da solunumun durmasına ve Hering-Breuer refleksi ile tutarlı olarak SpO₂ seviyelerinde en az% 5'lik bir azalmaya neden olmalıdır.
      NOT: Uygulamaya bağlı olarak, %5'ten daha az güvenilir bir SpO₂ düşüşü gözlenirse veya daha yüksek akım genlikleri (1,6 mA'ya kadar) güvenilir bir şekilde SpO_2'de en az %5'lik bir azalma sağlıyorsa, manşet işlevi kabul edilebilir olarak kabul edilebilir. Solunumun durması ve/veya SpO_2'de güvenilir bir azalma gözlenmemesi implant başarısızlığının göstergesidir.

Sonuçlar

Şekil 1: Uyarıcı manşet elektrotlarının montajı. (A) Manşetin her iki tarafındaki dikişleri sabitledikten sonra, Pt:Ir teli, bir dikiş iğnesi kullanılarak #1 numaralı delikten (beyaz ok ucu) manşet duvarından geçirilebilir. (B) Pt: Ir teli, m...

Malzemeler