Işık kaynaklı işitsel stimülasyon için fare dorsal koklear çekirdeğine virüs aracılı gen transferi

Bu makalede

Özet

Kaynak: Kozin, E. D., et.al. İşitsel yolun optogenetik stimülasyonu için murin dorsal koklear çekirdeğinin doğrudan görselleştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu video, ışığa bağlı işitsel stimülasyonu mümkün kılmak için fare dorsal koklear çekirdeğine (DCN) virüs aracılı gen transferini göstermektedir. Işığa duyarlı bir iyon kanalı olan opsin kodlayan bir viral vektör, doğrudan erişim için bir kraniotomi ve serebellar aspirasyonu takiben DCN'ye enjekte edilir. İfade edilen opsinler, nöronların ışıkla aktive edilmesine izin vererek, optogenetik kullanarak işitsel yol tepkilerini incelemek için bir model sağlar.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Serebellar Aspirasyon

5 Fransız aspirasyonu kullanarak, DCN görsel olana kadar DCN'nin üzerindeki sol serebellumun en lateral kısmını aspire edin (Şekil 1, Sağ Panel). Sol beyinciğin yaklaşık 1/4 ila 1/3'ünü çıkarın. DCN'nin bitişiğindeki ana dönüm noktası, üstün yarım daire biçimli kanalın ampullasıdır.
NOT: Beyincik aspirasyonu, protokolün en önemli adımıdır. Beyinciğin yönlendirilmiş aspirasyonu, kanamaya neden olacağından, aspirasyonun birden fazla geçişiyle değil, tek bir denemede meydana gelirse en başarılı şekilde gerçekleştirilir. Aspirasyona yardımcı olmak için, mikroskobun odak düzlemini, beyincik yüzeyine hafifçe distal olacak şekilde CN'nin beklenen derinliğine ayarlayın. Odak düzlemini CN'ye ayarlamak, görselleştirmeyi iyileştirecek ve keskin bir görüntü sağlayacaktır.
Aspirasyonu takiben, daha fazla kanama, beyin omurilik sıvısı (BOS) birikmesi ve DCN'de beyincik yer değiştirmesi beklenir. Kan pıhtılaşmasını önlemek için kraniyotomiye hızlı bir şekilde 0,5 cc steril salin damlatın. Daha sonra DCN'nin doğrudan görselleştirilmesi için bir yolu temizlemek için bir diş noktası ve emme ile nazikçe dokunmanın bir kombinasyonu kullanılabilir. DCN'nin yüzeyine doğrudan temas ettirmeyin.

2. Virüs Aracılı Gen Transferi ve Cerrahi Kurtarma için Basınçlı Mikroenjeksiyon

DCN'de kan ve BOS bulunmadığından ve açıkça görülebildikten sonra, 2 dakikalık bir süre boyunca 10 μl'lik bir Hamilton şırınga kullanarak DCN'ye basınçlı mikroenjeksiyonlar yapın.
İğneyi, uç DCN'nin yüzeyinin altında artık görünmeyene kadar bir mikromanipülatör ile tanıtın.
Optimum performans için, künt travmayı en aza indirmek ve enjeksiyon hacmini ince ve sığ bir beyin sapı yapısı olan DCN (<300 μm kalınlığında) DCN içinde lokalize etmek için 45° gibi sığ bir eğime sahip 33 veya 34 gauge iğne (34 gauge iğne ile gaz geçirmez bir şırınga kullanın) kullanın.
NOT: Diğer mikroenjeksiyon aletleri kullanılabilir. İdeal olarak, enjeksiyon aleti, DCN'yi doğrudan hedeflemek için gerekirse hafif bir bükülmeye izin verecek kadar esnek olmalıdır. Ayrıca, fare solunum nedeniyle prosedür boyunca hafifçe hareket ettiğinden, cihaz küçük miktarlarda harekete dayanacak kadar sağlam olmalıdır.

3. Cerrahi Kurtarma

Enjeksiyondan hemen sonra, cildi yeniden yaklaştırın ve farenin standart kurtarma prosedürüne göre iyileşmesine izin verin. Kalan beyincik ve skar dokusu, beyincik aspirasyonundan kaynaklanan boşluğu dolduracaktır. Sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinç yeniden kazanılana kadar hayvanları sürekli izleyin. Kalp atış hızını, solunum hızını ve beslenme yeteneğini izleyin.
NOT: Ameliyat geçiren hiçbir hayvan, tamamen iyileşene kadar diğer hayvanlarla birlikte kafese geri gönderilmez.
Bir fare ameliyat sonrası (vakaların %<5'i), tipik olarak cilt kesisinin kapatılmasından 2-4 saat sonra daireler çizerek yürümeye başlarsa, muhtemelen beslenmesi zor bir zaman geçireceğinden fareyi hemen feda edin. Bu yan etki muhtemelen beyincik aspirasyonundan kaynaklanmaktadır. Hayvan ameliyat sonrası ağrı açısından izlenmeli ve kurumsal standartlara göre hayvan konforunu sağlamak için uygun narkotikler verilmelidir. Enfeksiyon belirtisi varsa antibiyotikler gerekli olabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1: Kısmi serebellar aspirasyon, dorsal koklear çekirdeğe erişimi gösterir. Sol Panel: Fare tutucuya yerleştirildikten sonra, kafatasının arka yüzü boyunca cilt ve yumuşak dokudan boynun yumuşak dokusuna dikey olarak bir kesi yapılır. Deri ...