Ezilme yaralanmasını takiben bir farenin siyatik sinirinde aksonal rejenerasyon

Özet

Kaynak: Li, Q., et al. Memeli Akson Rejenerasyonunun Araştırılması: Yetişkin Fare Dorsal Kök Ganglionunun İn Vivo Elektroporasyonu. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, bir ezilme yaralanmasını takiben bir fare siyatik sinirinde aksonal rejenerasyon sürecini göstermektedir. İzole edilen sinir sabitlenir ve akson büyümesini görselleştirmek için nöronlarda eksprese edilen floresan proteinler ile görüntüleme için hazırlanır. Bir epifloresan mikroskobu kullanılarak, yeniden büyümenin derecesini değerlendirmek için yaralanma bölgesinden akson rejenerasyonu izlenir.

Protokol

1. Malzemeler ve Reaktifler

1. Animals
   1. Deneyler için 30-35 g ağırlığında altı haftalık dişi CF1 fareleri kullanın.
      NOT: Fareler, 1/4" mısır koçanı yatağı ve yuvalama için 2" kare yuvacıklar ile ayrı ayrı havalandırılan sterilize kafeslerde grup halinde barındırıldı (kafes başına 5 fare). Kafesler kontrollü 12 saatlik aydınlık-karanlık döngüsünde tutuldu ve oda sıcaklığı 19.4 °C ile 25 °C arasındaydı. Fareler, küresel bir kemirgen diyeti ve otomatik su tedarik sistemi ile beslendi.
2. Instruments
   1. Ameliyatı verimli bir şekilde yürütmek için aşağıdaki cerrahi aletleri kullanın: intraperitoneal enjeksiyon için tek kullanımlık şırıngalar (27 G, 1.0 mL), kürk makası, stereo diseksiyon mikroskobu, mikro cerrahi forseps, mikro cerrahi makası ve küçük kemik rongeurları ve sterilize edilmiş dokunmamış süngerler.
      NOT: Tüm alet ve malzemeler ameliyattan önce otoklavlanır veya üreticiler tarafından önceden sterilize edilir. Ameliyat sırasında, steriliteyi korumak için aletlere %75 alkol püskürtülür.
3. Anesthetic Solutions
   1. Anesteziyi indüklemek için anestezik solüsyon #1 kullanın ve anesteziyi sürdürmek için dorsal kök gangliyonları (DRG) enjeksiyonundan önce anestezi solüsyonu #2'yi kullanın.
      1. Anestezik çözelti #1 yapmak için, ketamin ve ksilazini steril salin içinde 10 mg / mL ve 1.2 mg / mL'lik bir son konsantrasyonda seyreltin.
      2. Anestezik çözelti #2 yapmak için, avertini steril salin içinde 20 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyonda seyreltin.
4. DNA Plazmid ve RNA Oligos<ol style='list-style-type:decimal;'>
5. Plazmitleri, üreticinin protokollerini uygun şekilde izleyerek ticari kiti kullanarak hazırlayın. Plazmid DNA'ları steril deiyonize su içinde 2.0 μg/μL konsantrasyonuna seyreltin.
6. Enjeksiyon sırasında DRG taslağının daha iyi görselleştirilmesi için %0,005-0,01 (h/h) nihai konsantrasyona ulaşmak için Hızlı Yeşil boya çözeltisi ekleyin.
7. Küçük enterferans yapan RNA'yı (siRNA) veya mikroRNA oligonükleotidlerini (mikroRNA oligoları), 50 μM'lik bir nihai konsantrasyona ulaşmak için üreticiler tarafından sağlanan ilgili tamponlarda çözün.

Mikro Enjeksiyon Pipeti

1. Mikropipet çekiciyi kullanarak kılcal camı çekin ve çekilen kılcal cam pipetin ucunu mikrocerrahi makasıyla yaklaşık 50 μm dış çapa sahip bir açıklık oluşturacak şekilde kesin. Ardından, cam pipeti UV ışığı altında temiz bir tezgahta yaklaşık 20-30 dakika sterilize edin.
2. Sterilize edilmiş cam pipeti, hücre içi mikroenjeksiyon dağıtım sistemine bağlı pipet tutucusuna monte edin. Mikroenjeksiyon sisteminin parametrelerini 30 psi basınç ve 8 ms süreye ayarlayın.

Elektroporasyon Sistemi

1. Elektrotları kare dalga elektroporasyon sistemine bağlayın ve aşağıdaki parametreleri ayarlayın: İn vivo elektroporasyon için 950 ms aralıklarla 35 V'ta 15 ms darbe

.

Perfüzyon ve Sabitleme Çözeltisi

1. Paraformaldehit (PFA) tozunu 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde %4 (a/h) konsantrasyonda çözün. PFA çözeltisini 4 °C'de saklayın.

2. Deneysel Prosedürler

1. L4 ve L5 DRG'lerin Cerrahi Maruziyeti
   Daha
   1. önce hazırlanan anestezik solüsyon #1'in intraperitoneal enjeksiyonunu kullanarak fareyi uyuşturun (ketamin 100 mg / kg vücut ağırlığı ve ksilazin 12 mg / kg vücut ağırlığı ile).
   2. Ameliyat bölgesini kürk makası ile tıraş edin.
      NOT: Sol siyatik sinir ezilmesi için başka bir ameliyat olacağından sol arka uyluk kürkü de aynı anda tıraş edilebilir.
   3. Fareyi ısıtılmış battaniyenin (35.0 °C) üzerine yerleştirin ve rektal sıcaklığı bir sıcaklık probu ile izleyin.
   4. Anesteziyi test etmek için farenin ayak parmaklarını ve kuyruğunu sıkıştırın ve davranışsal tepkileri gözlemleyin.
   5. Farenin dört uzvunu mantar pano üzerine bantlayın.
   6. Cerrahi bölgeyi bir iyodofor solüsyonu ile silin ve ardından cildi kesmeden önce iyodoforu çıkarmak için% 75 alkol kullanın.
   7. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için gözlere oftalmik merhem sürün.
   8. Kesizyondan önce, iliak tepelerin her iki tarafını da ince bir işaretleyici kalemle işaretleyin. L5 DRG'lerin konumlarını tanımlamayı kolaylaştırmak için iliak tepelerin iki noktasını birleştiren bir çizgi çizin.
   9. Mikromakasla alt sırtın orta hattı boyunca 3 cm'lik bir kesi yapın. Ayrıca, musculus multifidus ve musculus longissimus lumborum gibi paraspinöz kasları L3'ten S1'e kadar olan spinöz süreçlerden ayırın ve L4-5 ve L5-6'nın faset eklemlerini ortaya çıkarın.
   10. L4-5 ve L5-6'nın faset eklemlerini çıkarmak için bir mikro-rongeur kullanın. Ayrıca, DRG'lerin dorsal tarafını ortaya çıkarmak için L4 ve L5'in sol nöral kemerini çıkarın.
2. DRG Injection
   1. DRG enjeksiyonundan önce anesteziyi sürdürmek için intraperitoneal olarak anestezik bir solüsyon #2 (avertin 200 mg / kg vücut ağırlığı ile) enjekte edin.
   2. DNA plazmitlerini veya RNA oligolarını (DRG başına 1 μL) cam kılcal pipete yükleyin.
   3. Kılcal cam pipetin ucunu dikkatlice DRG'ye yerleştirin.
   4. Hücre içi mikroenjeksiyon dağıtım sistemlerini (30 psi, 8 ms) kullanarak DRG'ye kademeli olarak 1.0 μL DNA plazmidleri veya RNA oligoları çözeltisi enjekte edin.
      NOT: Enjeksiyonun süresi 5 dakikadan az sürmemelidir.
3. Electroporation
   1. PBS'yi elektrotların uçlarına bırakın.
   2. Kanamayı sterilize edilmiş kare pamuklu gazlı bezle temizleyin.
   3. Hedef DRG'yi elektrotlarla nazikçe sıkıştırın ve elektroporasyon sistemi ile 5 kare elektrik darbesi uygulayın.
   4. Kas ve cilt tabakalarını sırasıyla 5-0 naylon dikişlerle kapatın.
   5. Fareyi, sternal yaslığı korumak için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar yakından dikkat altında ısıtılmış bir battaniyenin (35.0 °C) üzerine yerleştirin. Anesteziden tamamen kurtulduktan sonra fareyi ev kafesine geri koyun.
      NOT: Farenin 37 °C battaniye üzerinde anesteziden tamamen iyileşmesi yaklaşık 60 dakika sürer. Ameliyat sonrası ağrıyı hafifletmek için günlük beslenme için bir hap (200 mg) ibuprofen'i 1.000 ml suya (0.2 mg / ml) çözün.
4. Sciatic Nerve Crush
   1. DRG elektroporasyonundan iki veya üç gün (deneysel tasarıma bağlı olarak), fareyi anestezik solüsyon #2 (avertin 400 mg / kg vücut ağırlığı ile) ile intraperitoneal olarak uyuşturun.
   2. Farenin dört uzvunu mantar pano üzerine bantlayın.
   3. Orta hat boyunca sol tarafa 0,5 cm 1 cm'lik bir kesi yapın. Gluteus maximus kası ve piriformis kası gibi kasları uzunlamasına kesin. Siyatik sinirin daha büyük siyatik foramen ve siyatik çentik arasındaki segmentini ortaya çıkarın.
   4. Mikrocerrahi forseps ile siniri 12 saniye boyunca ezin ve ezilme bölgesini 10-0 naylon epinöral sütür ile işaretleyin. Ezilme bölgesini işaretlemek için dural membran üzerinde bir düğüm atın.
   5. Kas ve cilt tabakalarını 5-0 naylon dikiş ile kapatın.
   6. Fareyi, sternal yaslığı korumak için yeterli bilinci tamamen geri kazanana kadar yakından dikkatli bir şekilde ısıtılmış bir battaniyenin (35.0 °C) üzerine yerleştirin. Anesteziden tamamen kurtulduktan sonra fareyi ev kafesine geri koyun.
      NOT: Farenin 37 °C battaniye üzerinde anesteziden tamamen iyileşmesi yaklaşık 60 dakika sürer. Ameliyat sonrası ağrıyı hafifletmek için günlük beslenme için bir hap (200 mg) ibuprofen'i 1.000 ml suya (0.2 mg / ml) çözün.
5. Fare Perfüzyonu, DRG ve Siyatik Sinir Hasadı
   1. Siyatik sinir ezilmesinden iki veya üç gün sonra (deneysel tasarıma bağlı olarak), fareyi anestezik solüsyon #2 ile intraperitoneal olarak uyuşturun.
   2. Fareyi transkardiyal olarak PBS (pH 7.4) ile perfüze edin, ardından PBS'de buz gibi% 4 paraformaldehit (PFA) (pH 7.5) uygulayın.
   3. Perfüzyondan sonra drg'ler sinir kökleri ve siyatik sinir ile birlikte diz öncesi mikromakas ve mikro forsepslerle dikkatlice diseksiyon mikroskobu altında dikkatlice ayrılır. Siyatik siniri gece boyunca 4 ° C'de doğrudan% 4 PFA'ya yerleştirin.
6. Floresan Etiketli Duyusal Aksonların Görüntülenmesi ve Ölçülmesi
   1. Sabit siyatik sinir üzerindeki yapışık doku ve zarı mikro makas ve mikro forseps ile diseksiyon mikroskobu altında dikkatlice sıyırın. Ardından,% 4 PFA'yı PBS ile değiştirin ve siniri üç kez yıkayın.
   2. Siyatik siniri bir slayta yerleştirin ve düz tutun. Sinirin etrafına 80 μL antifade solüsyonu ekleyin, ardından üzerine bir lamel koyun. Monte edilmiş tüm dokuyu basınçla düzleştirin.
   3. Düzleştirilmiş dokuları, mozaik alımı ve görüntü işleme için bir aksesuarla donatılmış ters çevrilmiş epifloresan mikroskobu üzerine yerleştirin.
      NOT: Uyarma ve emisyon uzunlukları 488 nm ve 509 nm'dir. Üst üste binen birden fazla görüntüyü manuel olarak çekmek ve Mosaic eklentisi ile ImageJ kullanarak görüntüleri birleştirmek de mümkündür.
   4. Rejenere aksonların uzunluğunu ölçerken, siyatik sinirdeki tüm tanımlanabilir floresan işaretli aksonları ezilme bölgesinden (10-0 epinöral sütür ile işaretlenmiş) distal akson uçlarına kadar izleyin.

Malzemeler