Nöral Hücre Süspansiyonunun Travmatik Beyin Hasarı Olan Bir Fareye Stereotaksik Nakli

Özet

Kaynak: Furmanski, O., et al. İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Nöral Hücrelerin Terapötik Nakli ile Fare Beyin Hasarının Kontrollü Kortikal Etki Modeli. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu videoda, insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevi sinir hücreleri, travmatik beyin hasarının bir fare modelinde derin korteksin gri madde-beyaz madde sınırına stereotaksik olarak enjekte edilmektedir. Nakledilen hücreler dokuya entegre olur ve yaralı beyinde fonksiyonel iyileşmeyi ve devre onarımını destekler.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Hücre süspansiyonunun stereotaksik transplantasyonu

1. : Kraniektomiden yaklaşık 24 saat sonra hücre nakli işlemine başlayın.
2. Hücre nakli ekipmanını ve cerrahi malzemeleri hazırlayın
   1. Yara irrigasyonu için 1 mL kayar uçlu şırıngayı steril tuzlu su ile doldurun. Sulamayı kontrol etmek için şırıngaya 25 G'lik bir iğne takın.
   2. İmmünosupresyon için 1 mL kayar uçlu şırıngayı CsA (Siklosporin A) çözeltisi ile doldurun. CsA şırıngasına 25 G veya daha büyük bir iğne takın. CsA şırıngasını ameliyatlar arasında gerektiği gibi yeniden doldurun.
   3. Standart yöntemleri kullanarak 1.0 mm OD (Dış çap) borosilikat cam kılcal pipetlerden cam iğneler hazırlayın.
   4. İğne uçlarını yaklaşık 200 μm çapa kadar kırmak için ince cımbız kullanın. İğnenin silindirik milinin 2,5 cm'den uzun olmadığından emin olun.
3. Şırınga pompasını 10 μL'lik bir şırınga ile kullanım için kalibre edin. Toplam 2,0 μL'lik bir hacim sağlamak için 0,2 μL/dk'lık bir akış hızı girin.
4. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre (hiPSC) süspansiyonunu hazırlayın.
   1. Standart steril işleme tekniklerini kullanarak bir hücre kültürü BSL-2 (Biyogüvenlik seviye-2) başlığında tüm hücre işlemeyi gerçekleştirin.
   2. Hücre kültürlerini, hücre tipi için tanımlanan standart koşullara göre önceden hazırlayın.
      NOT: Bu gösteride gösterilen deneyler, hiPSC'lerden türetilen çeşitli nöral fenotip hücrelerini kullanmıştır.
   3. Bir hücre ayırma çözeltisi veya diğer tercih edilen enzimatik veya kimyasal araçlar kullanarak hücreleri nazikçe tek hücreli bir süspansiyona ayırın.
   4. Süspansiyondaki hücreleri sayın, daha sonra süspansiyonu minimal hücre kültürü ortamında (örneğin, DMEM (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı)) 5 mL'lik bir kapaklı üst test tüpünde 1 x^{4 4} hücre / μL'ye seyreltin.
   5. Transplantasyon için aşağıdaki notlara uyun:
      1. Hücreleri prosedürler süresince 37 °C'de süspansiyon halinde tutun.
      2. Şırıngayı sadece intraparankimal enjeksiyon yapmadan hemen önce yükleyin
         NOT: Hücre süspansiyonu yan yatırılırsa, yerçekimi şırınganın yan tarafına yerleşmesine veya yapışmasına neden olarak enjekte edilen hücre sayısında düzensizliklere yol açabilir.
      3. Bir günde birden fazla hücre nakli prosedürü gerçekleştiriliyorsa, fare başına ~ 5 x 10⁵ hücre (10 μL süspansiyon) ayırın.
5. Stereotaksik transplantasyon ameliyatı gerçekleştirin
   1. Fareyi sıkıştırılmış oksijen kaynağına sahip bir izofluran buharlaştırıcıya bağlı bir anestezi indüksiyon odasına yerleştirin. ~ 0.7 L / dak oksijende ~% 3 izofluran ile anesteziyi indükleyin.
   2. Fareyi, bağlı bir anestezik burun konisi ile stereotaksik bir çerçeveye yerleştirin.
      1. Kafayı kulak çubukları ve bir ısırma çubuğu ile yerine sabitleyin, kafasını kafatasının ön kemiği yatay olacak şekilde yönlendirin. Ameliyat süresince anesteziyi %1.5 - %2 izofluranda tutun.
   3. Ameliyat öncesi bakım ve aseptik hazırlık yapın
      1. Pamuklu çubuk kullanarak gözlere antibiyotik içeren nemlendirici oftalmik merhem uygulayın.
      2. Bölgeyi temizlemek ve dikişleri gevşetmek için kesi bölgesini steril tuzlu su ile lavajlayın. Kesi bölgesini sterilize etmek için pamuklu çubukla nazikçe %70 etanol uygulayın.
   4. İnce cımbız ve oftalmik makas kullanarak dikişleri çıkarın. Ameliyat bölgesini yıkayın ve bol miktarda steril salin ile kraniektomi yapın.
      1. Korteks aşırı fıtıklaşma, renk değişikliği, bozulmuş vaskülarizasyon veya kanama gibi diskalifiye edici özellikler gösteriyorsa, hayvan dışlanmalıdır.
   5. Hücre nakli şırıngasını yükleyin
      1. Hücre süspansiyonunu 37 °C inkübatörden hücre kültürü biyogüvenlik başlığına taşıyın. Homojen bir hücre süspansiyonu sağlamak için tüpü hafifçe döndürün veya hafifçe vurun.
      2. Piston ucundan Hamilton şırıngasına ~ 7.5 μL hücre süspansiyonu yüklemek için bir mikro pipetleyici kullanın.
         1. Şırıngayı, piston ucu aşağı bakacak şekilde ~120° açıyla tutun. Süspansiyon ile piston ucu arasına hava kabarcığı girmemesine dikkat ederek pistonu yerleştirin.
      3. Conta tertibatını pipet iğnesine takın, ardından iğneyi şırıngaya takın.
      4. Hücre süspansiyonunu pipet iğnesine taşımak için pistonu itin. Süspansiyon çıkışına karşı direnç varsa, çapı büyütmek için iğne ucunu kırmak için ince cımbız kullanın.
   6. Şırıngayı stereotaksik şırınga pompasına takın. Şırınga pompası tertibatının düzgün çalıştığından emin olmak için pistonu ilerletin.
   7. İğneyi enjeksiyon için koordinatlara hareket ettirin.
      1. İğne ucunu bregma ile hizalayın. X ve Y koordinatlarını 0 olarak ayarlayın. Daha sonra iğne ucunu kraniektomi üzerinden bregmanın 2.0 mm lateral ve -1.0 mm posterior olacak şekilde hareket ettirin. İğne ucunu dura mater yüzeyine dokundurun ve stereotaksik koordinatı Z = 0 olarak ayarlayın.
      2. İğneyi beyne sokmadan önce hücre süspansiyonunun yeterince aktığından emin olmak için pistonu itin.
      3. İğneyi beyne Z = -1.4 mm derinliğe kadar sokun. Bu stereotaksik koordinatlar, grefti derin korteksin gri madde-beyaz madde sınırına yerleştirir.
   8. Hücre süspansiyonunu infüze etmek için şırınga pompasını çalıştırın. Laboratuvar tezgahı zamanlayıcısını 15 dakikaya ayarlayın ve zamanlayıcıyı başlatın. Hücre süspansiyon çıkışını izlemek için uzun bir çalışma mesafesi mikroskobu kullanın.
      1. Doku hidrasyonunu korumak için enjeksiyon sırasında ameliyat bölgesini steril tuzlu su ile sulayın.
      2. 15 dakika sonra nakil iğnesini yavaşça geri çekin. Ameliyat bölgesini tuzlu su ile yıkayın ve kesiyi dikişlerle kapatın.
   9. Ameliyat sonrası bakım yapın
      1. Anesteziyi durdurun. CsA'yı 10 mg / kg dozunda deri altına enjeksiyon yoluyla verin. Fareyi temiz ve önceden ısıtılmış bir ameliyat sonrası kafese yerleştirin.
      2. İçme suyunda 1.0 mg / mL'de asetaminofen analjezik sağlayın.
         NOT: Uygun Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) standart işletim protokolüne (SOP) göre ve deneysel sonuç değişkenlerini göz önünde bulundurarak analjezi sağlayın.
      3. Rehidrasyon ve toparlanmaya yardımcı olmak için nemli bir yem gıda geri kazanım kafesi sağlayın.
6. Farenin hayatta kalma süresi boyunca günlük CsA enjeksiyonlarına 10 mg / kg'da devam edin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1 ml şırınga	Becton Dickinson (BD)	309659
1.7 ml flip top test tüpleri	Denville	C2170
10 mikrolitre şırınga	Hamilton	7635-01
25G Hassas Kayma şırınga iğneleri	Becton Dickinson (BD)	305122
%70 Etanol			Tercih edilen ürün; bölgeye göre değişir
Asetaminofen oral süspansiyon	Tylenol (Çocuk)		Suda 1 mg / ml'ye seyreltin
Anestezik buharlaştırıcı	Vetland	0521-11-22
Hayvan taşıma bezi
Betadine	Purdue mağazasından	NDC-67618-151-32
Basınçlı oksijen			Tercih edilen ürün; bölgeye göre değişir
Siklosporin A	Sigma-Aldrich	30024-100mg
Dimetil sülfoksit (DMSO),	Sigma-Aldrich	D8418-500ml
DMEM	Invitrogen (ThermoFisher)	A14430-01
Elektrik bandı	3M Corporation		Mağazadan satın alın
İnce cımbız	Güzel Bilim Araçları	11254-20
Forseps	Güzel Bilim Araçları	91106-12
Cam kılcal pipetler, 1 mm Dış Çap, 0,58 mm İç Çap	Dünya Hassas Aletler	1B100F-3
Yüksek Hızlı Döner Mikromotor Kiti	Foredom Electric Co.	K.1070 - K.107018
5 Hücre Noktalı İdeal Mikro Matkap Çapak Seti	Scientific	60-1000
Leica Biosystems	için Darbe Bir Stereotaksik Çarpma Tertibatı	39463920
İzofluran	Baxter	NDC-10019-360-60
Lab tezgah zamanlayıcıları	Fisher Scientific	14-649-17
Mikropipet çektirme	MicroData Instruments, Inc.	PMP-102	Herhangi bir çektirme yeterli olacaktır
Mikroskop kapak kızakları	Fisherbrand	12-545-E
Mikroskop slayt montaj ortamı			Tercih edilen ürün
Ayna			Mağazadan satın alın
İğne tutucu kanama durdurucu	Güzel Bilim Araçları	12002-12
Oftalmik merhem	Falcon İlaç	NDC-61314-631-36
Oftalmik yaylı makas	Güzel Bilim Araçları	15018-10
Plastik kutu			Mağazadan satın alın
Plastik silindir			Mağazadan satın alın
QSI motorlu şırınga pompası	Stoelting	53311
Çıkarılabilir iğne sıkıştırma bağlantısı	Hamilton	55750-01
Küçük kemirgen stereotaksik çerçeve	Çalmak	51925
Küçük makas	Güzel Bilim Araçları	14060-09
StemPro Accutase	Invitrogen (ThermoFisher)	A1110501
Steril alkol hazırlama pedleri	Fisherbrand	06-669-62
Steril pamuklu çubuklar/Kendall Q-ipuçları	Tyco Healthcare	540500
Steril tuzlu su	Hospira	NDC-0409-1966-07
Kronometreler (2)	Fisher Scientific	06-662-56
Superfrost Plus Gold mikroskop slaytları	Fisherbrand	15-188-48
Sütürler - 5.0 kavisli iğne ile ipek	Vaha	MV-682

satın alın Ürünler , CCI