Alfa-sinüklein ekspresyonunun epigenetik regülasyonu için nöral progenitör hücrelerin lentiviral transdüksiyonu

Özet

Kaynak: Tagliafierro, L., et al. Epigenom Düzenleme Araçlarının İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Hastalık Modellerine Verimli Bir Şekilde Sunulması için Lentiviral Vektör Platformu. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu video, Parkinson hastalığında önemli bir protein olan alfa-sinükleinin hedeflenen epigenetik modifikasyonu için nöral progenitör hücrelerin (NPC'ler) lentiviral transdüksiyonunu göstermektedir. Protokol, metiltransferaz aracılı DNA metilasyonunu mümkün kılarak, gen regülasyonunu ve potansiyel terapötik müdahaleleri incelemek için SNCA ekspresyonunu azaltır.

Protokol

1. Dopaminerjik nöral progenitör hücrelerin farklılaşması

1. MD NPC'lerin çözülmesi (orta beyin dopaminerjik nöral progenitör hücreleri)
   1. BMM (temel matris zarı) kaplı bir plaka hazırlayın ve tam N2B27'yi ısıtın. 15 mL'lik konik bir tüpe 10 mL ılık DMEM / F12 ekleyin. Bir kriyoviyal 37 dakika boyunca 2 °C'lik bir ısı bloğuna yerleştirin.
      1. Hücreleri kriyoviyalden DMEM/F12 içeren tüpe aktarın. 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
      2. Süpernatanı aspire edin, hücreleri 2 mL N2B27'de yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu BMM kaplı plakanın bir oyuğuna ekleyin. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO₂ ile inkübe edin.

2. MD NPC'lerin transdüksiyonu ve metilasyon değişikliklerinin analizi

1. MD NPC'lerin Transdüksiyonu
   MD
   1. NPC'leri LV (lentiviral vektör)-kılavuz RNA/deaktive edilmiş Cas9-DNMT3A (DNA metiltransferaz enzimi 3A) vektörleri ile MOI'de (enfeksiyonun çokluğu) %70 birleştiğinde dönüştürün = 2. N2B27 ortamını 16 saat sonra transdüksiyondan sonra değiştirin.
   2. Transdüksiyondan 48 saat sonra 5 μg / mL puromisin ile N2B27 ekleyin. Stabil MD NPC hatlarını elde etmek için hücreleri N2B27 artı puromisin içinde 3 hafta boyunca kültürleyin. Hücreler aşağı akış uygulamaları (DNA, RNA, protein analizleri, fenotipik karakterizasyon, dondurma ve paslama) için hazırdır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Ekipman
15 mL konik santrifüj tüpleri	Corning	430791
6 kuyulu plakalar	Corning	3516
Allegra 25R masa üstü santrifüj	Beckman Coulter	369434
Ters floresan mikroskobu	Leica	DM IRB2
Hücre kültürü reaktifleri
Antibiyotik-antimikotik çözelti, 100X	Sigma Aldrich	A5955-100ML
B-27 Takviyesi (50X), eksi A vitamini	Thermo Fisher Scientific	12587010
Corning Matrigel hESC Nitelikli Matris	Corning	08-774-552
DMEM-F12	Lonza	12-719
N-2 Takviyesi (100X)	Thermo Fisher Scientific	17502001
Neurobazal Orta	Thermo Fisher Scientific	21103049