Bir farede utero viral transdüksiyon

Özet

Kaynak: Lutz, D., et al. Gelişmekte Olan Fare Beyin ve Omuriliğinin İn Utero Transdüksiyonu Sonrası Ultrastrüktürel Nöroplastisite Parametrelerinin Değerlendirilmesi. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu video, fare embriyolarında rahim içi enjeksiyon yoluyla viral transdüksiyonu göstermektedir. Ameliyat için hamile bir fare hazırlanır ve rahim boynuzlarını ortaya çıkarmak için orta hat kesisi yapılır. İstenilen geni içeren bir virüs ve takip boyası karışımı, hedeflenen yerlerde rahim keseleri içindeki embriyolara enjekte edilir. Rahim boynuzları daha sonra dikilmeden önce geri yerleştirilir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Utero Transdüksiyonda

1. : pH 7.4'te fosfat tamponlu salin (PBS) içinde istenen hedefi (4 x 10,¹¹ viral partikül / μL AAV1) kodlayan adeno-ilişkili virüs tip 1'i (AAV1) hazırlayın. 0.1 mg/μL Fast Green ekleyin ve AAV1-Fast-Green karışımını 37 °C'de tutun.
2. Bir mikropipet çektirme kullanarak istenen şekle sahip (8 mm uzunluğunda, dış çapı 80 μm ve iç çapı 50 μm) ince bir kılcal uç hazırlayın (ayarlar: basınç = 500, ısı = 700, çekme = 0, hız = 80, zaman = 200, Malzeme Tablosuna bakın). Kılcal damarın ucunu 4-5 mm olacak şekilde kırın.
3. Kılcal uç ile bir aspiratör tüpü (44 cm x 0,7 cm) monte edin ve 15 μL AAV1-Fast-Green karışımını kılcal damara aspire edin.
4. Hayvan denekleri tüm prosedür boyunca 37 °C'lik sabit bir fizyolojik vücut sıcaklığında tutun.
5. Hamile bir C57Bl / 6 faresini (embriyonik gün 14.5) ön inkübasyon odasına yerleştirin ve fareyi gaz halinde% 4 izofluran (0.6-0.8 L / dak hacimsel hava akış hızı ile) ile uyuşturun.
6. Deri altına buprenorfin (vücut ağırlığının 0.1 mg/kg'ı) enjekte edin.
7. Anestezi uygulanmış fareyi önceden ısıtılmış cerrahi plakaya (37 °C) yerleştirin.
8. Gözleri bir kayganlaştırıcı ile örtün.
9. Fareyi anestezi maskesi (0,6-0,8 L/dk hacimsel hava akış hızında gaz halinde% 1,5 izofluran) ile cerrahi plakaya yerleştirin ve karın derisi bölgesini tıraş edin. Traş edilmiş bölgeyi 3X %75 etanol ve ardından betadin solüsyonu ile silin.
   NOT: Anestezi uygulanmış farenin solunum davranışını sürekli olarak izleyin. İzofluran gazının konsantrasyonunu farenin soluma-soluma modeline göre ayarlayın.
10. Farenin arka pençe falankslarını sıkarak plantar refleksin yokluğunu kontrol edin.
11. Cildi kavisli tırtıklı iris forseps (10 cm) ile kavrayarak ve cildi düz tungsten karbür makasla (10 cm) linea mediana boyunca keserek karın boşluğunu açın ve ardından periton duvarını düz Dumont cımbızla (12 cm, 0,2 mm x 0,12 mm) kavrayarak ve düz Vanna makasıyla (8 cm) linea alba boyunca duvarı keserek açın.
12. Karın açıklığına bir parça fenestre parafin filmi yerleştirin ve filmi her iki ucuna mikro sivrisinek hemostatik forseps (12,5 cm, kavisli) ile sabitleyin.
13. Rahim boynuzlarının içindeki embriyolara zarar vermemek için rahim boynuzlarını kaşık benzeri bir cihazla açığa çıkarın. Rahim boynuzlarına birkaç damla PBS (37 °C) damlatın ve embriyoları rahim kesesi içinde hasar veya malformasyon açısından inceleyin.
14. Rahim boynuzlarındaki embriyoların sırasını ve konumunu belgeleyin. Enjeksiyon için istenen pozisyona ulaşılana kadar embriyoları uterus kesesinin içinde dikkatlice çevirin.
15. Enjeksiyon bölgesini (örneğin beyin ventrikülleri) ve boya penetrasyonunu stereomikroskop altında görsel olarak inceleyerek 1-2 μL AAV1-Fast-Green karışımı enjekte edin.
16. Enjekte edilen embriyoları belgeleyin ve enjekte edilen embriyolarla birlikte uterus boynuzlarını karın boşluğuna geri yerleştirin.
17. Karın boşluğuna birkaç damla PBS (37 °C) damlatın. Halsted'in sivrisinek hemostatik forsepslerini (12,5 cm, kavisli) kullanarak periton duvarını (poliamid 6-0 boyutlu dikişler kullanın) ve cildi (poliamid 3-0 boyutlu dikişler kullanın) dikerek boşluğu kapatın. Alternatif olarak, karın boşluğunu ve cildi kapatmak için basit bir kesintili desen veya paslanmaz çelik dikiş/zımba kullanın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
26Gx 1'' iğne	Henke-Sass, Wolf GmbH
410 Hava pompası için Anestezi Ünitesi	Biyomedikal Aletler (Univentor)	8323102
Adeno ilişkili virüs serotip 1 (AAV1)	UKE (Viral Çekirdek Tesis)	-	AAV1'in referansları ve hedef alanları için bakınız: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ ve ayrıca: Tasarımcı gen dağıtım vektörleri: gelişmiş gen transferi için adeno-ilişkili viral vektörlerin moleküler mühendisliği ve evrimi. Kwon Ben, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mart; 25(3):489-99. 1, 2 ve 5 serotiplerinden viral kapsidlerle psödotiplenmiş rekombinant AAV viral vektörleri, merkezi sinir sisteminin farklı bölgelerine verildikten sonra diferansiyel verimlilik ve hücre tropizmi gösterir. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Öğr. 2004 Ağustos; 10(2):302-17. Kendini tamamlayan rekombinant adeno-ilişkili virüs (scAAV) vektörleri, DNA sentezinden bağımsız olarak verimli transdüksiyonu destekler. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gen Ther. 2001 Ağustos; 8(16):1248-54.
Hava Pompası Biyomedikal	Aletler (Univentor)	Eheim 100
Aspiratör ayar tertibatları	Sigma-Aldrich	A5177-5EA
Solunum Maskesi Fare Eloksallı Alüminyum Biyomedikal	Aletler (Univentor)	-
Buprenorfin	Temjezik	ampuller	ağrı kesici
Kılcal damarlar	Bilim-Ürünler	GB100TF-10	dolgulu
Dumont cımbız (#3, 12 cm, düz, 0,2 x 0,12 mm)	FST	11203-23
Elektrikli tıraş makinesi	Phillips	-
Ethicon sütürler (Ethilon, 6-0 ve 3-0)	Etikon-poliamid
Göz yağlayıcı	Bepanthene	-
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7252	enjekte edilen sıvıların görselleştirilmesi için
Gaz Yönlendirme Anahtarı 4/2 konnektör	Biyomedikal Aletler (Univentor)	8433020
Halsted Sivrisinek hemostatik forseps (12,5 cm, düz)	FST	13011-12
Yatay hareket eden kapaklı fareler için indüksiyon kutusu.İç boyutlar: LxBxH: 155x115x130 mm.Duvar kalınlığı: 6 mm	Biyomedikal Aletler (Univentor)	-
İris forseps (10cm, kavisli, tırtıklı)	FST	14007-14
İris makası (11cm, düz, tungsten karbür)	FST	14501-14
Isofluran OP Tisch, elektrikle ısıtılmış, smDış boyutlar: 257x110x18 mm.Isıtma alanı: 190x90 mmSolunum maskesinden kaçan izofluranın çıkarılması, yönetmeliklere uygun olarak aşağıya doğrudur.	Biyomedikal Aletler (Univentor)	-
İzofluran (Attan)	JD tıbbi		inhalasyon anestezisi
Işık mikroskobu Temel DM E	Leica-4x		(N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) hedefler
Mikropipet çekme	Bilim-Ürünler	P-97
Sivrisinek hemostatik forseps (12,5 cm, kavisli)	FST	13010-12
Termopuller P-97	Sutter Instruments
Tygon 6/4 Tüm parçaların bağlantısı için boru malzemesiDış çap: 6mmİç çap: 4mmDuvar kalınlığı: 1mm	Biyomedikal Aletler (Univentor)
Vannas makas (8 cm, düz)	FST	15009-08