İnme Sonrası Fare Modeline Hidrojelin Stereotaktik Enjeksiyonu

Özet

Kaynak: Wilson, K.L., et al. İnme Sonrası Beyne Hidrojel Biyomateryal İskele Enjeksiyonu. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu video, inme sonrası bir farenin inme çekirdeğine bir hidrojelin stereotaksik enjeksiyonunu göstererek, hücre dışı matrisi taklit eden, hücresel infiltrasyonu destekleyen ve anjiyogenezi destekleyen iskele oluşumundaki rolünü vurgulayarak inme iyileşmesindeki nöroterapötik potansiyelinin altını çizmektedir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

Hidrojel veya diğer biyomalzemelerin enjeksiyonu

1. : Biyomalzemelerin enjeksiyonunu kullanıcı tarafından tanımlanan bir zamanda gerçekleştirin. Bu deneyde, inme sonrası 5 ila 7 gün arasında enjeksiyonlar yapıldı. 2 - 6 μL hidrojel enjekte edilir.
   1. Anestezi sırasında farenin vücut sıcaklığını (37 °C) korumak için ısıtma yastığını açın.
   2. Otoklavlı makas, forseps, pamuk, veteriner gözü merhemi, cerrahi yapıştırıcı veya dikiş malzemesi, steril alkol ve beta iyot mendilleri hazırlayın. Steril matkap ucu başlıkları ile kemik matkabını ve metal 30 G iğneli 25 μL cam Hamilton şırıngaları hazırlayın.
   3. Fareler arasındaki aletlerin sterilizasyonuna izin vermek için boncuk sterilizasyonunu 160 ° C'ye getirin.
   4. Enjeksiyon pompalarını stereotaksik cihaza takın. Akış hızını 1 μL/dk'ya ayarlayın ve hacmi 4 μL'ye ayarlayın.
   5. Ameliyattan sonra fareler için temiz bir kafes hazırlayın.
2. Fareyi, spontan hareket durana ve solunumu yavaş, sabit bir hıza gelene kadar uyuşturmak için% 4'lük bir izofluran konsantrasyonuna sahip indüksiyon odasına yerleştirin.
   1. Uyuduktan sonra, fareyi %1,5'lik bir idame izofluran konsantrasyonuna sahip stereotaksik cihaza aktarın ve sabitleyin.
   2. Veteriner göz merhemini her iki göze de uygulayın.
   3. Farenin kafasından yeniden çıkmış olabilecek tüyleri tıraş edin ve bir alkollü mendil ve ardından bir beta iyot mendili kullanarak alanı aseptik olarak hazırlayın. Üç kez tekrarlayın.
      NOT: Gerekirse, cilt tahrişine neden olduğu ve farelerin ameliyattan sonra kafataslarını kaşındırmasına neden olduğu için tüm beta iyotu temizlemek için sonunda ekstra bir alkollü mendil kullanın.
3. Küçük makas ve/veya forseps kullanarak beynin üzerindeki cildi yeniden açın. Kafatasındaki kalıntıları temizlemek için steril tuzlu su veya PBS (Fosfat tamponlu tuzlu su) ile pamuk kullanın. Beyaz-sarı bir daire (kontur, Şekil 1B) ve matkaptan çıkan çapak deliği görünecektir. Ölü doku görünmüyorsa, muhtemelen inme meydana gelmemiştir. Çapak deliği strokun üzerinde ortalanmamışsa, ortalamak için yeniden delin.
4. Enjeksiyon pompasını farenin üzerine yönlendirin ve 90°'de kilitleyin. Malzemeyi geri yüklemeden önce şırıngayı steril salin veya PBS solüsyonu ile temizleyin.
   1. Temizledikten sonra, cam şırıngayı iğne kalmayacak şekilde sökün. Şırıngayı 10 μL hidrojel (veya burada hücreli veya hücresiz başka bir biyomateryal) ile 25 μL pozitif yer değiştirmeli bir pipet kullanarak geri yükleyin.
   2. Şırınga pistonunu kullanarak jeli şırınganın önüne kadar itin. Ardından, şırıngayı tekrar monte edin ve jel iğneden gözle görülür şekilde sızana kadar itmeye devam edin.
5. Şırıngayı pompanın üzerine yerleştirin. Şırınganın oturması için pompanın arkasının ayarlanması gerekebilir. Akış hızını 30 μL/dk'ya ayarlayın, hareket etmesi gereken yöne bağlı olarak Çekme veya Enjekte Et'i seçin ve ardından Başlat'a basın. Pompanın arkası doğru konumdayken Durdur'a basın.
   1. Şırınganın sağlam olması için pompanın arkasını vidalayın. Daha önce ayarlamalar yapılmışsa, akış hızının tekrar 1 μL/dk'ya ayarlandığından ve enjekte edilmek üzere ayarlandığından emin olun.
6. Pompayı deliğin üzerine yönlendirmek için x ve y yönlerinde hareket ettirin. Şırınganın iğnesi deliğin üst kısmına değene kadar pompayı z yönünde aşağı doğru hareket ettirin.
7. Dijital ekran konsolundaki Z'yi sıfırlayın. Ardından şırıngayı z yönünde 0,750 mm aşağı doğru hareket ettirin. Şırınga bükülürse veya direnç varsa, kafatası ya iyileşmiştir ya da tamamen delinmemiştir ve yeniden delinmesi gerekir.
8. 1 μL/dk hızında 4 - 6 μL hidrojel enjekte etmek için pompa konsolunda Başlat'a basın.
9. Jelenin çapraz bağlanmaya başlamasına izin vermek için pompa enjeksiyonu durdurduğunda 5 dakikalık bir zamanlayıcı ayarlayın.
10. 5 dakika sonra, z-nob'u çevirerek şırıngayı yavaşça yukarı çekin. Delikten yanlışlıkla herhangi bir malzeme çekilip çekilmediğini veya sızıp sızmadığını görmek için izleyin. Pompanın kilidini açın ve iğne kafatasından yeterince uzakta olduğunda fareden uzaklaştırın.
11. Forseps, cerrahi yapıştırıcı veya dikişler kullanarak başın üstündeki cildi kapatın. Fareyi temiz kafese yerleştirin ve iyileşmesini gözlemleyin. Farenin anesteziden kurtulması yaklaşık 5 – 10 dakika sürmelidir.

Sonuçlar

Şekil 1: Bregmanın şematik gösterimi ve inmenin lokalizasyonu. (A) Parietal loblar, bregmayı oluşturmak için üstte buluşur. Lazer yerleşimi bregmanın 2.0 mm solunda ortalandı. (B) İnmeden 5 gün sonra inme ve...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
25uL Hamilton Şırınga 702RN, iğnesiz	Fishcer Scientific	14824663	Biyomalzemeleri enjekte etmek için kullanılan şırıngalar
25uL Pozitif deplasmanlı pipet	Gilson	M-25
Ayarlanabilir Sahne Platformu	Kopf Aletler	901
C57BL / 6 Fareler	Jackson Laboratuvarı	664	8-12 haftalık
Kafes Montajı Rob	Thorlabs	ER3-P4	3 "Uzun, çap 6mm, 4 paket - sterotax Pamuklu Çubuklara lazer takmak için
VWR		89031-288
CP 25 pipet ucu	Gilson	F148012
Isıtma Plakası	Kopf Aletler	HP-4M
IMPAC 6 Entegre Çok Hastalı Anestezi Merkezi	VetEquip	901808
Jewlers Forseps # 5	GFS kimyasalları	46085
Miltex Adson Pansuman Forseps, Disecting dereceli	Intefra Miltex	V96-118
Mini pompa değişken akışlı	Thomas Scientific	70730-064	Pompa perfüzyonlar
Fare Gazı Anettezi Kafa Tutucu	Kopf Instruments	923-B
Nanojet Kontrol Kutusu	Chemyx	10050
Nanojet pompa başlığı	Chemxy	10051	Biyomateryal İğnesi enjekte etmek için stereotaksik cihaza takın
RN 30G PT STY 3, 0.5 inç	Fishcer Scientific	NC9459562
Yırtılmayan kulak çubukları 60º	Kopf Instruments	922
Puralube Veteriner Merhem	Dr. Foster Smith	9N-76855
Rektal Prob Fare	Kopf Aletleri	Ret-3-ISO
Sol-M U-100 1/2 birim işaretli insülin şırınga 0,5 mL	VWR	10002-726	Gül bengal enjekte etmek için
StainTray Slayt Boyama Sistemi	Simport Scientific	M920-2	Slaytları boyamak için
Sterotaxic cihazı	Kopf Instruments	940	Küçük Hayvan Stereotaksik Alet
Öğrenci Adson Forseps -1x2 diş	Güzel Bilim Araçları	91127-12
Öğrenci İnce Forseps - düz/geniş Shanks	Güzel Bilim Araçları	91113-10
Sıcaklık Kontrol Cihazı	Kopf Instruments	TCAT-2LV
Tissue-Tek OCT bileşiği	VWR	25608-930
Vetbond Doku Yapışıklığı 3mL	Santa Cruz Biyoteknoloji	sc-361931