Dişi Fare Modelinde Meme Tümörü İlerlemesinin Biyolüminesans Görüntülemesi

Özet

Kaynak:
Marina Arantes Radicchi¹, Victor Carlos Mello¹,
Victória Paz Machado¹, Márcia Cristina Oliveira da Rocha¹, Jaqueline Vaz de Oliveira¹, Luana Cristina Camargo^1,2, Luís Alexandre Muehlmann¹, Ricardo Bentes Azevedo¹, Sônia Nair Bao¹, João Paulo Figueiró Longo<sup>1

1</sup>Biyolojik Bilimler Enstitüsü, Brasília Üniversitesi, ²Temel Psikolojik Süreçler Bölümü, Psikoloji Enstitüsü, Brasília Üniversitesi

Bu video, lusiferaz eksprese eden meme adenokarsinom hücrelerini dişi bir fareye enjekte ederek ve zaman içinde birincil ve metastatik tümör büyümesini değerlendirmek için biyolüminesans sinyalleri izleyerek in vivo tümör ilerlemesini izleme prosedürünü göstermektedir

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Hücre kültürü

1. Bir murin meme adenokarsinom hücresi olan 4T1 hücre hattını (ATCC-CRL-2539), %10 fetal sığır serumu (v:v), penisilin (100 U/mL) ve streptomisin (100 U/mL) ile desteklenmiş DMEM ortamı (Dulbecco'nun modifiye kartal ortamı) ile kültürde 37 ° C'de ve% 5_CO2 içeren nemlendirilmiş bir atmosferde koruyun.
2. Orijinal hücre hattını, lusiferazı eksprese eden Luc2 geni ile transfekte edin. Bu biyolüminesan enzim yapısal olarak üretilir.

2. Hayvan modeli - Tümör hücresi nakli

1. Biyolüminesans, lusiferaz eksprese eden 4T1 hücrelerini (fare başına 2 × 10⁵ hücre) anestezi altında Balb/c dişi farelerin sol sırtına deri altından aşılayın (sırasıyla 80 mg/kg ve 10 mg/kg'da ketamin ve ksilazin).
   1. Bu prosedür için, belirtilen anestezik ajanların intraperitoneal enjeksiyonunu (sırasıyla 80 ve 10 mg / kg'da ketamin ve ksilazin) kullanarak deneyden önce fareyi uyuşturun.
   2. 5 dakikalık anestezi indüksiyonundan sonra, fareyi tıraş edin ve 1 mL insülin şırıngaları kullanarak hücreleri deri altına enjekte edin.
      NOT: Tümör indüksiyonu ve görüntüleme için her biri yaklaşık 25 g ağırlığında toplam beş adet 8 haftalık fare kullanıldı.
2. Tümör büyümesini in vivo olarak ölçmek için, tümör taşıyan fareyi 4 hafta boyunca tümör büyümesini izleyerek biyolüminesans görüntüleme ile değerlendirin.
   1. Biyogörüntüleme deneyleri için, fareyi izofluran (arıtılmış basınçlı havada% 2,5 seyreltilmiş) ile uyuşturun. Tümör ilerlemesini değerlendirmek için, biyolüminesans sinyallerini ölçen ekipman kullanarak fareyi 4 hafta boyunca haftada bir kez görüntüleyin.
      NOT: 4T1-luc lusiferaz biyolüminesans sinyali, büyümeyi değerlendirmek ve tümör ilerlemesini göstermek için bir parametre olarak kullanıldı.
3. Görüntüleme işlemi sırasında, biyolüminesans görüntüleri yakalamak için fareyi ekipmanın belirlenen alanı içinde dorsal yatar pozisyonda konumlandırın.
4. Anesteziden sonra, fareye intraperitoneal olarak D-lusiferin (100 μL; 15 mg / mL) enjekte edin.
   NOT: D-lusiferin, bölündüğünde ışık fotonları üreten lusiferaz enzimi için bir substrat olduğundan ve 4T1-biyolüminesan lusiferaz hücreleri bu enzimi yapısal olarak eksprese ettiğinden, canlı hayvanlarda tümörü ölçer ve tespit eder.
5. Sinyalleri tespit etmek için, her uç noktada her hayvan için 20 dakika boyunca 20 biyolüminesans görüntü yakalayın. Bu görüntülerin her biri, 60 saniyelik bir süre boyunca yayılan biyolüminesans sinyalini temsil eder.
6. Her dakika yayılan sinyali temsil eden bir biyolüminesans kinetik eğrisi oluşturun. Her hayvan için en iyi sonuçları elde etmek amacıyla, her son nokta için maksimum biyolüminesans emisyonunu kaydedin.
7. Biyolüminesans görüntü yakalama için aşağıdaki parametreleri kullanın: emisyon filtresi açık, uyarılma olmadan, gruplama 8, f/stop 2 ve görüş alanı tipi-D. Bir büyüme eğrisi oluşturmak için, hayvanları toplam 4 hafta boyunca haftada bir kez görüntüleyin.
8. Biyolüminesans görüntüleme - Primer Tümör ve Akciğer Metastazı.
   1. Birincil tümör ve akciğer metastazı sinyallerini ayırt etmek için, ekipmanın yazılımını kullanarak belirli ilgi alanlarını tanımlayın.
   2. Enjeksiyon bölgesindeki ve hücrelerin metastaz yaptığı torasik bölgedeki biyolüminesans sinyallerini tanımlayın. Bu görüntülere dayanarak, tümör ilerlemesi ile güçlü bir şekilde ilişkili olan biyolüminesans sinyalinin ilerlemesini hesaplayın.
   3. Birkaç hafta boyunca toplanan görüntülerle, birincil tümör ve metastatik lezyonlar dahil olmak üzere farklı tümör bölgeleri için bir büyüme kinetik profili oluşturun.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
D-lusiferin	Perkin Elmer	122799	Kimyasal Reaktif
Dulbecos'un modifiye edilmiş Kartal médyum'u	Gibko	A7030 Serisi	Hücre Kültürü Ortamı
Fetal Sığır Serumu	Merck	F2442 Serisi	Hücre Kültürü Medya Eki
İzofluran	Cristália	NA	Anestezik
IVIS Lumina	XR	Seri III	Ekipman – ABD
Penisilin	Merck	P4333	Hücre Kültürü Antibiyotiği
Falloidin-Alexa Flor 488	Termo Fischer	A12379 Serisi	Kimyasal Reaktif
Fosfat tampon salin	Merck	4437568	Kimyasal Reaktif
Streptomisin	Merck	P4333	Hücre Kültürü Antibiyotiği