Method Article

Opsonize Kırmızı Kan Hücreleri Kullanarak In Vitro Komplement Aracılı Fagositoz Modellenmesi

January 30th, 2026

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaynak: Nagre, N. ve diğerleri. Alveolar makrofaj fagositoz ve farelerde bakteri temizlemesi. J. Vis. Exp. (2019).

Bu video, IgM ve komplement ile opsonize edilmiş koyun kırmızı kan hücreleri kullanılarak komplement reseptörü aracılı fagositozun değerlendirilmesini ve ardından fare makrofajları tarafından alınmasını göstermektedir. Fagositoz kapsamı, diaminoflorenin hemoglobin-katalize edilmiş oksidasyonuyla oluşan mavi kromojenik ürünün ölçülmesiyle ölçülür.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. FcγR- ve CR aracılı Fagositoz

  1. Opsonizasyon için, 2 x 108 koyun kırmızı kan hücresini (SRBC) 50 μL tavşan anti-SRBC-IgM veya 50 μL tavşan anti-SRBC-IgG ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kuluçka altına alın.
  2. IgM kaplı SRBC'lerde komplement parçaları C3b ve C3bi'yi 37 °C'de 30 μL C5 eksikliği olan (C5D) insan serumu ile inkübe etmek için IgM opsonize SRBC'leri 30 dakika boyunca inkübe edin.
  3. Tohum faresi makrofaj hücreleri (MH-S hücreleri) (10.000 hücre/kuyu) 96 delikli bir plakada inkubasyon yapın ve ~%70 birleşme elde etmek için gece kuluçka yapın. Her MH-S hücre kuyusuna 100 μL 100 μL opsonize SRBC ekleyin ve 37 °C'de 1 saat kuluçka yapın. Bağlanmamış SRBC'leri çok hızlı (~1 dakika) 100 μL amonyum klorür-potasyum (ACK) lizis tamponu ile yıkayın.
  4. Hücreleri %0,1 SDS ile lizle yapın ve %3 hidrojen peroksit ve 6 M urea içeren 50 μL 2,7-diaminofloren (DAF) ekleyin. 620 nm'de hemoglobinle katalize edilmiş floren mavisi oluşumunun emilimini ölçin.
  5. SRBC sayısını, bilinen sayıda SRBC ile 620 nm absorbans değerinde standart bir eğri kullanarak belirleyin. Benzer şekilde, MH-S hücrelerini opsonize edilmemiş SRBC'lerle inkubasyon ederek negatif kontrol olarak kullanmak üzere işle.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2,7-diaminofloren (DAF)Sigma-AldrichD17106Moleküler Biyoloji derecesi
%70 etanolDecon Labs Inc.18C27BAnalitik derecelendirme
96 kuyu plakasıCorning3603Hücre Biyolojisi derecesi
ACK lizis tamponuYaşam TeknolojileriA10492Moleküler Biyoloji derecesi
C5 eksikli serumSigma-AldrichC1163Biyokimyasal reaktif
SantrifüjLabnet InternationalC0160-R 
Sitospin 4 SitosentrifüjThermofisher ScientificA78300101 Sayı 11 
DMEM Hücre Kültürü MedyasıGibco11995-065Hücre Biyolojisi derecesi
FBSAtlanta Biyolojik ŞirketleriS11550Hücre Biyolojisi derecesi
Akış SitometresiBD BiosciencesFACSCalibur 
Flow Jo SoftwareFlowJo, LLC  
ForsepsDumont0508-SS/45-PS-1Laboratuvar hayvanı diseksiyası için uygun
Cam taban çanakMatTek Corp.P35G-0.170-14-CHücre Biyolojisi derecesi
Yüksek Basınçlı ŞırıngaPenn-YüzyılıFMJ-250Laboratuvar hayvanları kullanımı için uygun
HomojenizerOmni InternationalTH-01 
Hidrojen peroksitSigma-AldrichH1009Analitik derecelendirme
Ters Flüoresans MikroskobuOlympusIX73 
MicroSprayer AerosolizerPenn-YüzyılıIA-1CLaboratuvar hayvanları kullanımı için uygun
ParaformaldehitSigma-AldrichP6148Reaktif sınıfı
PBSGibco20012-027Hücre Biyolojisi derecesi
tavşan anti-SRBC-IgGMP Biyomedikal55806İmmüno-testler için uygundur
tavşan anti-SRBC-IgMCedarline LaboratuvarlarıCL9000-Mİmmüno-testler için uygundur
MakasMiltex5-2Laboratuvar hayvanı diseksiyası için uygun
koyun kırmızı kan hücreleri (SRBC)MP Biyomedikal55876Yıkanmış, korunmuş SRBC'ler

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Complement Mediated PhagocytosisOpsonized Red Blood CellsC3bi DepositionMacrophage Phagocytosis AssayHemoglobin Catalyzed OxidationDiaminofluorene DetectionAmmonium Chloride LysisSodium Dodecyl SulfateSpectrophotometer AbsorbanceStandard Curve Quantification

Related Articles