İnsan Akciğer dokusunda Bakteriyel Lokalizasyon ve Konak Etkileşiminin Görüntülemesi

Özet

Kaynak: Mills, B. ve ark., Konfokal Lazer Endomikroskopi ile İnsan Akciğer Dokusunda Ex Vivo Bakteri-Spesifik Probların Optik Taraması. J. Vis. Exp. (2017)

Bu video, lifli konfokal floresan floresan mikroskopi ile süspansiyon ve akciğer dokusunda floresan etiketli Staphylococcus aureus'un gerçek zamanlı görüntülemesini sunmaktadır.

Protokol

1. Konfokal lazer endomikroskopi (CLE) ile veri toplama
   1. Kurulumdan sonra, depolama yerini ve dosya ön ekini seçmek için bir pencere açılır. Veri depolama için istediğiniz klasörü seçin ve öneki buna göre adlandırın.
   2. Ayak pedallarını operatörün kolayca erişebileceği şekilde yerleştirin. Sol pedal: lazer açıp/kapalı; Orta pedal: duraklama; Sağ pedal: kaydet/durdur.
      NOT: Lazer kontrollerine ayrıca ekrandaki kontroller aracılığıyla erişilebiliyor.
   3. Ekranda 'başlat' tuşuna tıklayın veya lazeri açmak için sol ayak pedalına basın. Bu, %100 lazer gücü ve 12 kare/s kare hızı (varsayılan ayarlar) kullanarak görüntüleri almaya ve elde etmeye başlar.
      NOT: Diğer uygulamalar için, bu ayarlar gerekirse örnek türüne bağlı olarak ekranda değiştirilebilir.
   4. Her bir bakteri süspansiyon örneğini görsün.
      1. FCFM (Fiberli konfokal floresan mikroskopisi) görüntüleme lifinin distal ucunu yerleştirin ve lifi süspansiyon boyunca yavaşça hareket ettirerek örneği sorgulayın.
      2. Sağ ayak pedalına basarak veya ekrandaki kayıt kontrollerini seçerek (10 dakikaya kadar) herhangi bir uzunlukta video kaydedebilirsiniz; çünkü fiber sample'ın etrafında yavaşça hareket eder.
      3. FCFM görüntüleme lifinin distal ucunu %8 H₂O₂ ile temizleyin ve örnekler arasında lens temizleme dokuları kullanın. ​
         NOT: Tipik 10-30 saniyelik video uzunlukları in vitro görüntüleme için yeterlidir.
   5. Her bir akciğer dokusu örneğini görsün.
      1. FCFM görüntüleme lifinin distal ucunu numuneye yerleştirin, böylece lifin ucu ile doku arasında doğrudan temas sağlanır. Görüntüleme lifinin ucunu nazikçe hareket ettirerek örneği sorgulayın.
         NOT: Lifin ucunu dokudan uzaklaştırmak, dokuyu odak düzleminden uzaklaştırır; ancak bu, dokuya yapışmayan etiketlenmiş bakterileri görüntülemek için kullanılabilir.
      2. Sağ ayak pedalına basarak veya ekrandaki kayıt kontrollerini seçerek (10 dakikaya kadar) herhangi bir uzunlukta video kaydedebilirsiniz; çünkü fiber sample'ın etrafında yavaşça hareket eder.
         NOT: Genellikle, 30 saniyelik video süreleri doku üzerinde ex vivo görüntüleme için yeterlidir.
      3. FCFM görüntüleme lifinin distal ucunu lens temizleme dokuları ve örnekler arasında %8 H₂O₂ ile temizleyin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1-14 Mikrofuge	SciQuip	90616	Küçük tezgah üstü mikrosantrifüj
96 kuyu plakası	Corning	3370	Test plakası
Calcein	Sigma Aldrich	17783	Ticari floresan boya
Cellvizio 488 nm Araştırma CLE	Mauna Kea Teknolojileri	LC-0001-488	Konfokal lazer endomikroskopi cihazı
Cletop-S	Cletop	14110601	Fiber temizleyici
Eppendorf (1.5 mL)	Eppendorf	30120086	1.5 mL mikrofüj tüpü
Gibco Fosfat Tamponlu Tuzlu Su	Thermo Fisher Scientific	10010023	PBS - yıkama medyası
IC-Görüntüleyici	Mauna Kea Teknolojileri	LW-0001	CellVizio 488 nm sistemi araştırma için veri toplama ve işleme yazılımı
Standart olmayan araştırma AlveoFlex 488 nm	Mauna Kea Teknolojileri	MP-0002-AF3	Lifli konfokal floresans mikroskopi lifi
Quanti Kit 488 nm	Mauna Kea Teknolojileri	LQ-0005	CellVizio 488 sistemi için kalibrasyon kiti
S. aureus ATCC 25923	ATCC	25923	Bu çalışmada kullanılan bakteri suş
Yarı-mikro spektrofotometri küveti	Sigma Aldrich	C5416-100EA	Spektrofotometri için
Termomikser konforu	Eppendorf	41102422	Sallamalı tezgah üstü ısıtıcı