Bağırsak mikrobiyotasının zenginlenmesi için Caenorhabditis solucanlarının seçici temizlenmesi

Özet

Kaynak: Morgan, E. ve diğerleri. Bağırsak mikrobiyomu bakterilerini zenginleştirmek amacıyla yabani caenorhabditis nematodlarının seçici temizlenmesi. J. Vis. Exp. (2021)

Bu video, yabani Caenorhabditis solucanlarından ilgilenen bağırsak bakterilerinin izole edilmesi için bir protokolü göstermektedir. Solucanlar önce açlıktan kurtulup yıkanarak yüzeylerinden ve bağırsak lümenlerinden kalan besleyici bakterileri yok ederken, hedef mikropları korur. Yüzey temizliği ve birden fazla sürünme adımından sonra, solucanlar incelenerek ilgilenilen bakterileri içeren bağırsaklar çıkarılır, ardından toplanıp dondurularak depolanır.

Protokol

1. Mikrobiyal türlerin bağırsak diseksiyası ve PCR olarak tanımlanması

1. Hayvanları 20 °C'de 3-4 gün boyunca yetiştirerek aç kalmalarını ve OP50-1 (Escherichia coli süzü OP50-1) bakterilerinin miktarını azaltmasını sağlayın. Aç solucan tabakasına 5 mL M9 ortamı ekleyin.

2. Steril bir cam pipet ve ampul kullanarak, M9 + solucanları plakadan pipetleyin ve steril 15 mL'lik santrifüj tüpüne aktarın.

3. Klinik santrifüj kullanarak, tüpteki solucanları oda sıcaklığında 1000 x g ile 30 saniye boyunca döndürün.

4. Steril 15 mL pipet kullanarak, tüpün altındaki canlı solucanları rahatsız etmeden santrifüj borusundan süpernatantı çıkarın.

5. 10 mL M9 + %0,05 Triton X-100 ekleyin ve tüpü bir nutatorda 20 dakika kuluçka geçirerek dış mikropları çıkarın. Solucanları yıkamak için dört kez tekrarlayın.

6. Son yıkamadan sonra, steril pipet ucu kullanarak, 100 μL çözelti içindeki tabandaki pelleti rahatsız etmeden üst yüzeyi çıkarın.

7. Steril pipet ucu kullanarak M9 ve solucanları tohumlanmamış bir NGM plakasına aktarın ve solucanlar 20 dakika boyunca sürünerek OP50-1'i kütikül ve bağırsaktan çıkarmaya yardımcı olurken plakanın kurumasına izin verin.

8. Kurutulmuş plakaya 250 μL M9 ekleyin ve M9 + solucanları yeni, tohumlanmamış bir NGM plakasına aktarmak için cam pipet kullanın. Yine, o tabağı kurutsun ve solucanların 20 dakika boyunca sürünmesine izin verin.

9. Plakaya 250 μL M9 ekleyin ve 100 μL M9 + solucanı temiz bir saat camına aktarın.

10. İki steril 26 G şırınga iğnesi kullanarak, bir iğneyle solucanı aşağıda tutarak diğer iğneyi kullanarak solucanı keserek nematodların kafasını kesin. Kafa kesildikten sonra, vücuttan bağırsak (granül) ve gonad (şeffaf) doğal olarak vücuttan çıkar.

11. Bir iğneyle bağırsağı bastırıp diğeriyle keserek açıkta kalan bağırsağın bir parçasını kesin.

NOT: Mümkünse, Normarski mikroskopisi, floresans in situ hibridizasyon (FISH) veya immünohistokimya ile ilgili mikrobun hâlâ egilmiş bağırsaklarda var olup olmadığını doğrulayın.

12. Tek bir diseksiyon edilmiş bağırsağı, içinde 10 μL steril su içeren 0,5 mL PCR tüpüne aktarın. Farklı hayvanlardan alınan bağırsakları içeren en az 5 PCR (polimeraz zincir reaksiyonu) tüpü için tekrarlayın.

13. PCR tüplerini -80 °C'de en az 5 dakika dondurun. PCR tüplerini dondurucudan çıkarın ve örnekleri eritin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Agarose	Fisher Scientific	BP1356
%10 SDS	Invitrogen	AM9822
BD PrecisionGlide İğne - 26 G	Fisher Scientific	305115
KH₂PO₄	Fisher Scientific	P-286
NaCl	Fisher Scientific	S-671
NH₄Cl	Fisher Scientific	A-661
Streptomisin	Millipore-Sigma	S6501-50G
Tetrasiklin	Millipore-Sigma	T7660-5G
Triton X-100	Fisher Scientific	BP-151
Saat gözlükleri	VWR	470144-850