Fare bağırsak bakterilerinin fare bağırsak kesitlerinde yerinde floresans hibridizasyonu

Özet

Kaynak: Ng, K. M., Tropini, C. Bağırsak mikrobiyota-konak etkileşimlerinin Floresans Yerinde Hibrizleşme, Lektin Boyanması ve Görüntüleme Yoluyla Görselleştirilmesi. J. Vis. Exp. (2021).

Bu video, fare bağırsak dokusunda bağırsak mikrobiyotasını boyandırmak için floresan probları bakteriyel rRNA'ya (ribozomal ribonüklein asit) hibritize ederek ve mikroskobik analiz için konak yapılarını karşı boyama yoluyla fare bağırsak dokusunda bağırsak mikrobiyotasını boyama prosedürünü göstermektedir.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, ilgili hayvan etik inceleme komitesi tarafından incelenmiş ve onaylanmıştır

1. FISH ile bakteriyel boyama (Floresans in situ hibridizasyon)
   1. Her doku kesitinin çevresinde daire çizerek sıvı genleşme alanını sınırlamak için sıvı engelleyici veya PAP pen (hidrofobik bariyer kalemi) kullanın. Mürekkebin bölüme temas etmediğinden emin olun. Hibritizasyon çözeltisi tarafından kaplanması gereken yüzey alanını en aza indirmek için doku bölümüne temas etmeden mümkün olduğunca yakın bir daire oluşturun.
   2. Hibritizasyon çözeltisi hazırlanır: her 50 μL önceden ısıtılmış hibritizasyon çözeltisi için 0,5 μg prob ekleyin (örneğin, 0,5 μL 1 μg/μL prob). Hibritizasyon çözeltisini slayttaki kesitlere pipetleyin (~20 μL/kesit, kesit/daire boyutuna bağlı olarak). Hibritleşme çözümünü ve slaytları bu noktadan itibaren kuluçka aşamaları ve depolama sırasında ışıktan koruyun.
   3. Kullanılan sıvı hacminin esnek plastik bir kapak örtüsüyle örtüldüğünde tüm bölümü kapladığından emin olun. Buharlaşmayı azaltmak için kaydırmayı nemli bir odada kuluçka altına alın. Nemli bir oda oluşturun; altına altı, fazla hibritizasyon çözeltisi veya fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) ile ıslatılmış bir pipet uçlu kutu veya kağıt havlular ile nemli bir oda oluşturun. Bölümleri sonda setine bağlı olarak 45-50 °C sıcaklıkta, >3 saat boyunca kuluçka edin.
   4. FISH yıkama tamponunu ısıtın: 20 mM Tris-HCl, pH 7.4; Kuluçka döneminde 0,9 M NaCl'den 50 °C'ye kadar sıcaklık gösterir. Coplin kavanozunda slaytları kapatacak kadar yıkama tamponu hazırlayın.
   5. Plastik kapak örtüklerini çıkarın; Slaytları FISH yıkama tamponu içinde Coplin kavanozunda, her ikisi de önceden 50°C'ye ısıtılmış şekilde inkübe yapın. Coplin kavanozunu tekrar 50°C fırına 10-20 dakika koyun. Kalın örnekler için, Coplin kavanozundaki örtükleri tampon ekleyerek çıkarın ve dilimin bulaşmasını önlemek için örtü kapaklarını nazikçe çıkarın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Coplin kavazonu	Fisher	08-813E
Kapak camı, 22 × 22 mm, #1 numaralı	VWR	CA48366-227-1
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	5 mg/mL'ye yeniden askıya alındı
Boş pipet uç kutusu(lar)			Parafini eritmek için
FISH sondaları
FISH hibridizasyon çözümü	--	--	20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl, %0.01 (w/v) Nükleaz içermeyen suda SDS. %5–50 (v/v) formamid isteğe bağlı ekleme
FISH yıkama tamponu	--	--	20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl
Fluoresans etiketli Ulex Europaeus Agglutinin (UEA-1) lektin	Vektör Laboratuvarları	FL-1061 (Floressein etiketli) veya RL-1062-2 (Rodamin etiketli)	UEA-1, fukosillenmiş glikanları etiketler, bu nedenle mikropsuz fareler veya fukosiltransferaz 2 (FUT2) eksikliği olan konaklardan alınan örnekler için uygun değildir.
Forseps
HybriSlip esnek plastik kapak slipleri, 22 x 22 mm × 0.25 mm	Sigma Aldrich	GBL722222	FISH hibritleşme adımları için, cam örtü örtüleri yerine kullanılabilir
ImmEdge Hidrofobik Bariyer PAP Pen	Vektör Laboratuvarları	H-4000
Kimwipe
Çok Amaçlı Numune Depolama Konteynerleri, 473 mL	Fisher	14-955-117A	Tercih ettiğiniz cam veya polietilen kap ile değiştirebilirsiniz. Metakarn, polistiren veya metal ile uyumlu değildir.
Tırnak ojesi	Elektron Mikroskopi Bilimleri	72180	Her türlü oje işe yarar
Fırın			Gerekli menzil: 45-60 °C
PBS, Fosfatla tamponlanmış tuzlu (10x çözelti çözüm)	Fisher	BP3991	Protokol için 1x'e kadar seyrelt
Sodyum klorür	Fisher	S271
Trizma hidroklorür çözeltisi, 1M Tris-HCl, pH 7.4	Sigma-Aldrich	T2663-1L
Su, nükleazsız	Fisher	BP2484100