Legionella pnömofila dış zar veziküllerinin ultrasantrifüj tabanlı izolasyonu

Özet

Kaynak: Jung, A. L. ve diğerleri. Legionella pneumophila Dış Zar Vezikülleri: Makrofajlarda Pro-inflamatuar Potansiyellerinin İzolasyonu ve Analizi. J. Vis. Exp. (2017)

Bu video, Legionella pnömophila'dan dış zar veziküllerinin (OMV) ardışık santrifüj, steril filtrasyon ve ultrasantrifüjasyon kullanılarak izole edilmesini göstermektedir. Zar proteinleri ve lipopolisakkaritlerle zenginleştirilmiş saflaştırılmış OMV'ler, konak-patojen etkileşim çalışmaları için uygundur.

Protokol

1. Legionella pnömofila'yı yetiştirin

1. L. pneumophila sürünü Corby (yabani tip, WT) tamponlu kömür maya ekstraktı (BCYE) agar plakalarına yayın ve 37 °C'de 3 gün boyunca kuluçka yapın. Ön kültür plakasından alınan L. pneumophila ile OD₆₀₀ 0.3 ile 10 mL maya özlü çorbası (YEB) aşılayın; bakterileri 37 °C'de döner bir sallayıcıda (150 rpm) 6 saat kuluçka yapın.
2. Sıvı kültürün saflığını, süspansiyonun 100 μL'sini bir kan agar plakasına yayarak doğrulayın. 37 °C'de gece kuluçka yapın.
3. Kalan sıvı kültürü 90 mL taze YEB ortamına ekleyin ve döner bir çalkalayıcıda (37 °C ve 150 rpm) kuluçka yapın, böylece yaklaşık 16-20 saat süren 3.0-3.5 OD₆₀₀ elde edilir.

2. L. pneumophila Dış zar veziküllerini (OMV) hazırlayın ve nicelikle ölçebilirsiniz

NOT: Aşağıdaki santrifüj adımlarının tamamını steril koşullarda ve 4 °C'de gerçekleştirin.

1. Sıvı kültürü 4.000 x g ile 20 dakika boyunca santrifüjlenerek bakterileri peletleyin. Süpernatantı yeni santrifüj tüplerine aktarın, bakteriyel pelleti atın ve santrifüjasyonu tekrarlayın (4.000 x g 20 dakika boyunca). Bu adımı bir kez tekrarlayın.
2. Kalan süpernatantı iki kez steril filtrele (gözenek boyutu: 0.22 μm). Bakterisiz süpernatantı ultrasantrifüj tüplerine aktarın ve 100.000 x g hassasiyette 3 saat boyunca ultrasantrifüj yapın.
3. Süpernatantı boşaltın ve atın. OMV pelletini steril fosfat-tamponlu salin (PBS) ve ultrasantrifüj (100.000 x g, 3 saat) içinde yeniden askıya alın, böylece kirletici proteinler ve LPS giderilebilir.
4. Süpernatantı atın ve OMV pelletini 500 μL steril PBS ile yeniden askıya alın. Hazırlanan veziküllerin bakteriyel kontaminasyonunu önlemek için kan agarı plakasında ve BCYE agar plakasında 20 μL çizgi kalın. Kan agar plakasını gece boyunca ve BCYE agar plakasını 3 gün boyunca (her ikisi de 37 °C'de) kuluçka edin.
   NOT: 100 mL L. pneumophila kültürünün konsantrasyonu genellikle 1 μg/μL'dir. Hazırlanmış ve nicel edilmiş OMV'leri -20 °C'de depolayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
10 cm Petri kabı	Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Almanya)	82.1473
70 Ti rotor	Beckman Coulter Incorporation (Kaliforniya, ABD)	337922
Küvetler	Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Almanya)	67.742
Heracell 240i CO₂ kuluçka makinesi	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Almanya)	40830469
Heraeus Çok Füge X3R	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Almanya)	75004515
Aşılama döngüsü	Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Almanya)	86.1567.010
L. pneumophila Corby	---	---
PBS	Biochrom GmbH (Berlin, Almanya)	L 1825
Döner sallayıcı (MaxQ 6000)	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Almanya)	SHKE6000
Ultrospec 10	Biochrom Ltd (Cambridge, İngiltere)	80-2116-30
Steril filtre (gözenek boyutu: 0.22 μm)	Corning Incorporated (New York, ABD)	431096
Aktif kömür	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Almanya)	X865.2
Agar-agar, Kobe I	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Almanya)	5210.2
%5 koyun kanı içeren Columbia agarı	Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Almanya)	254005
Maya ekstraktı	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Almanya)	2363.2