Caenorhabditis elegans ile ilişkili bakterilerin izolasyonu ve yetiştiriciliği

Özet

Kaynak: Petersen, C. ve ark., Model Nematod Caenorhabditis elegans'ın Doğal Mikrobiyotasının İzolasyonu ve Karakterizasyonu. J. Vis. Exp. (2022)

Bu video, Caenorhabditis elegans ile ilişkili bakteri türlerinin izolasyonu ve yetiştirilişini göstermektedir. C. elegans'ın boncuk bazlı lizisi ve ardından seçici kültürleme, çeşitli mikrobiyal suşların daha ileri analiz için izole edilmesini sağlar.

Protokol

1. Nematodla ilişkili bakterilerin izolasyonu ve yetiştirilmesi (Şekil 1)

1. Bakterileri izole etmek için, her kuyu başına üç steril 1 mm boncuk, her kuyu başına 20 μL M9 minimal orta tuz (M9) tamponu içeren 96 kuyu talı bir tabaka hazırlayın ve her kuyuya bir tek yıkamalı nematodu pipetleyin; mümkün olduğunca az sıvı aktarılır.
   NOT: Alternatif olarak, solucan popülasyonları M9-tampon ile plakalardan yıkanabilir ve ~300 μL solucan içeren M9-tampon 10-15 boncuklu 2 mL tüplere aktarılabilir.
2. Nematodları bir boncuk homojenizatoru kullanarak parçalayın (örneğin, 30 Hz'de 3 dakika boncuk dövme). Sıvıyı tabana ulaşmak için plaka veya tüpleri kısa süreliğine santrifüjle yapın (örneğin, oda sıcaklığında 8000 x g ile 10 saniye, RT).
   NOT: Bu yöntemin kullanımı, 16S ribozomal DNA (rDNA) amplikon dizileme ile ortaya çıkarılanlara benzer bakteriyel taksonların izolasyonuna yol açtı; bu da tarif edilen boncuk dövmesinin çoğu bakteri hücresini sağlam bıraktığını düşündürmektedir.
3. Üst yüzeyi toplayın, seri olarak 1:10 oranında seyreldin ve 100 μL'ye kadar 9 cm agar plakalarına yerleştirin.
   1. Çoğu bakterinin yetiştirilebilmesini sağlamak için, seyreltilmiş triptikaz soya agar (TSA, 1:10 seyreltme), MacConkey agar, Sabouraud glikoza agar, patates dekstroz agar veya maya pepton dekstroz agar gibi farklı besin bileşimlerine sahip çeşitli alternatif ortamlar kullanın.
4. Plakaları, örnekleme alanının ortalama sıcaklık koşullarında (örneğin, ılıman bölgelerde 15-20 °C arasında sıcaklıklar) 24-48 saat boyunca kuluçka edin.
5. Saf bakteriyel kültürler elde etmek için standart üç çizgili tekniği ve steril bir döngü kullanın (Şekil 1).
   1. Bir plakadan steril bir halka veya kürdanla tek bir koloni seçin ve onu saflaştırma için kullanılan aynı agar ortamını içeren yeni bir agar plakasına çizerek yerleştirin. Plakanın sadece yaklaşık üçte birini kullandığınızdan emin olun.
   2. Ya yeni bir steril halka kullanın ya da tekrar kullanılabilir bir halka sterilize edin ve onu ilk çizgiden geçirerek aynı plakanın üçte bir kısmında ikinci bir çizgi oluşturun.
   3. Bu adımı ikinci çizgiden steril bir halka sürükleerek tekrarlayın.
   4. Plakayı izolasyon için kullanılan aynı büyüme koşullarında kuluçka yapın. Bu teknik, üçüncü çizgi bölgesinde tek kolonilerin büyümesine yol açmalıdır.
      NOT: Doğal izolasyonlar biyofilm ve/veya agregalar oluşturduğu için arındırma adımını birden fazla kez tekrarlamak gerekebilir.
6. Saf kolonileri, yukarıdaki sıcaklık ve büyüme süresiyle (adım 1.4) aynı sıcaklık ve büyüme süresi kullanılarak sıvı bir ortamda (agar ortamıyla aynı türde) yetiştirin (adım 1.4).

Sonuçlar

Şekil 1: Bireysel bakterilerin tür tanımlaması ve izolasyonu. Bireysel nematodlar boncuk homojenizatörü kullanılarak parçalanır ve DNA , PCR veya dizileme ile tür belirleme için izole edilir. Alternatif olarak, parçalanmış nematod maddesi seri ol...