$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modelleriyle ilgili tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından incelenmiştir.
1. Hücre İçi Bakteriyel Topluluk (IBC) İzolasyonu: IBC'lerin Ağız Pipetlenmesi
NOT: Bu bölümde açıklanan tüm yöntemler kurumsal bir risk değerlendirmesinden geçmiştir. Ağız pipetleme, aktarılan çözeltinin içsel olarak kabul edilme riskini taşır. Bu risk, protokolün kullandığı nanolitre hacimleriyle büyük ölçüde azaltılır ve protokol kullanıcılarının burada ve tartışmada listelenen önlem ve uygulama notlarına dikkat etmelerini öneririz.
- Hücreler PBS'ye (fosfatla tamponlanmış salin) kazıdıktan sonra, ağız mikropipetleme cihazı kuruldu (Şekil 1C).
- Çekilen cam kapillerin kalın ucunu (çekilmemiş uç) aspiratör tüpünün kauçuk tıkacına (beyaz ucu) yerleştirin.
- 1 mL'lik pipet ucunun dar ucunu aspiratör borusunun diğer açık (kırmızı) ucuna yerleştirerek sıkı bir uyum sağlanır.
- 2 mL'lik aspirasyon pipetinin dar ucunu 1 mL pipet ucunun açık, daha geniş ucuna yerleştirin, böylece yine sıkı bir uyum sağlanır.
NOT: Ortaya çıkan düzen, araştırmacının pipeti daha geniş ve açık ucundan ağızla pipet yaparak cihazın diğer ucundaki kapiller tüpünün dar ucundan hafif bir emme kuvveti oluşturmasını sağlar. - Son ağız mikropipetleme cihazını, taze deiyonize su içeren 100 mm Petri kabı ile test edin. Aspirasyon pipetinin açık ucunda hafif bir emici (pipetle içecek içmeye benzer) kapillerdeki sıvı seviyesini artırmalı, ancak deiyonize suyun aspiratör tüpüne taşmasına neden olmaz. Bir elinizle kapiller tüpünü kontrol edin, diğer elinizle Petri kabının konumunu ayarlayın.
NOT: Tek bir IBC'nin ağızdan pipetlenmesi için gereken emme gücü araştırmacılar arasında değişiklik gösterecektir. Ancak, bu tekniği deneyen her araştırmacının zayıf bir emici ile başlaması ve kapiller boyunca sıvı akmıyorsa yavaş yavaş artırması önerilir. İçmek için pipetten emmekten daha büyük bir güce gerek yoktur. Eğer step 1.1.4'teki test sırasında kapiller sıvı algılamıyorsa, kapiler veya aspirasyon tüpünün tıkanmış olması ve değiştirilmesi gerekebilir. Ayrıca, tüm yeni araştırmacıların önce sterilize edilmiş su kullanarak ağız pipetleme cihazında emici kontrol etmeyi uygulamaları önerilmektedir. Ayrıca, ağız pipetleme cihazının aldığı hacmin kontrolünün araştırmacının dili aracılığıyla gerçekleştiğini unutmayın. Dil, uygulanan emme gücünü ince bir şekilde ayarlayabilir ve acil bir durdurma görevi de verir. - Sıvıyı başarılı şekilde alıma ulaştıktan sonra, aspirasyon pipetinin açık ucuna nazikçe üfleyerek sıvıyı kapiler bölgeden dışarı atma yeteneğini test edin. 1.5. adımda sıvının dışarı atılma sürecinde IBC'lerin kontaminasyonunu önlemek için baloncukların oluşmadığından emin olun.
NOT: Emizme gibi, araştırmacının IBC'yi santrifüj tüpüne fırlatmak için uyguladığı pozitif basıncın gücü araştırmacılar arasında değişecektir. Bu protokole yeni başlayan araştırmacıların, enfeksiyondan birkaç gün önce 1.1. adımı uygulamaları önerilir. Ağız mikropipetleme pratiği için öneri, küçük hacimlerde sterilize edilmiş suyu birkaç damla gıda boyası ile (görünürlük için) ağız mikropipeti cihazı ile aktarmayı pratik yapmaktır.
- Kazınan hücre süspansiyonunu diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin ve IBC'leri büyük floresan agregalar olarak tanımlayın (Şekil 1A, B). İdeal büyütme aralığı 20-40x'tir. Cam kapillerin ince ucunu 1 saniye boyunca yeni bir PBS tüpüne batırarak istenmeyen hacmin kapiller etkisiyle alınmasını azaltın.
- Mikroskopla incelenerek ilgilendiğiniz IBC'yi belirleyin ve kapiller tüpün açık ucunu yavaşça IBC'ye doğru getirin. Cam kapillerin ince ucunu kullanarak her IBC'nin yakınındaki ekstra hücreleri süpürerek iki veya daha fazla hücrenin aspirasyonunu önleyin veya daha büyük hücre agregasyonlarını parçalayın.
- Mikroskoptan bakarken, ağız mikropipetleme cihazının uzak ucuna (aspirasyon pipeti) çok küçük bir emme kuvveti uygulayarak IBC'yi cam kapiler içine yönlendirin.
- IBC'yi aldıktan sonra, kapilleri boş bir 1,5 mL santrifüj tüpüne taşıyın ve hafif bir pozitif basınç uygulayarak damlayı ve IBC'yi santrifüj tüpüne atın (Şekil 1D).
- Mevcut mesaneden gerekli olan IBC sayısında 1.3-1.6 numaralı adımları tekrarlayın, ardından bir sonraki mesane için geçin. Tükürük birikmesini önlemek için aspirasyon pipetlerini ve kapillarları sık sık değiştirin.
DIKKAT: Enfeksiyon (veya klinik) bakteri suşlarıyla çalışırken, kapillerdeki çözelti seviyesini sürekli izleyin. Pipotlenen sıvı seviyesinin kapiller kenarından aspiratör tüpüne taşmasına izin vermeyin. Böyle bir durum olursa, hemen farklı bir aspiratör tüpüne geçin ve önceki kurulumu bırakın. - Tüm hasat edilen mesanelerde veya deneysel grup için yeterli sayıda biyolojik örnek toplanana kadar 1.2-1.6 adımlarını tekrarlayın.
- (İsteğe bağlı) Tüm deneysel gruplar (veya fareler) ötenazilenene ve her gruptan yeterli biyolojik örnek alınana kadar 1.6 ve 1.7 adımlarını tekrarlayın.
