Bakteri Enfekte Fare Beyninde Hedef Gen İfadesinin Tespiti

Özet

Kaynak: Zhang, S. ve diğerleri. Fare enfeksiyonu modelinde menenjitte streptococcus suis biyofilmlerinin rollerini araştırmak için intrakraniyal subaraknoidal enfeksiyon yolu. J. Vis. Exp. (2018).

Bu video, bakteri enfekte bir fare beyninde hedef gen ifadesinin tespitini gösteriyor. RNA çıkarılır, DNA bozdurucu bir enzimle işlenir ve cDNA'ya ters transkribe edilir. cDNA, gen spesifik primerlerle termal döngüyle amplifikasyon yapılırken, DNA bağlayan bir boya amplifikasyon DNA'ya bağlanarak floresans yayar. Floresans sinyalleri, hedef genin varlığını doğrulamak için analiz edilir.

Protokol

1. Bakterilerin Hazırlanması

Not: Streptococcus suis (S. suis) serotip 2 virulent suş P1/7, menenjitli hasta bir domuzdan izole edilmiştir. P1/7 süzü Todd-Hewitt çorbasında yetiştirildi (THB, THB litresi başına formül: Kalp İnfüzyonu, 3,1 g; neopepton, 20,0 g; dekstroz, 2,0 g; sodyum klorür, 2,0 g; disodyum fosfat, 0,4 g; sodyum karbonat, 2,5 g) ve Todd-Hewitt agar üzerinde (THA, THA'nın litresi başına formül: Kalp İnfüzyonu, 3,1 g; neopepton, 20,0 g; dekstroz, 2,0 g; sodyum klorür, 2.0 g; disodyum fosfat, 0,4 g; sodyum karbonat, 2,5 g; agar, 15.0 g) 37 °C'de ve %5_CO2.

1. P1/7 planktonik hücrelerinin suş koleksiyonu
   1. Orta log faz kültüründen (OD₆₀₀=0.6) 5 ml planktonik hücre toplayın, 8000 × g'de 3 dakika santrifüj yapın ve ardından fosfatla tamponlu tuzlu (PBS) 3 kez yıkayın.
   2. Hücreleri 5 mL %25 gliserol THB ile yeniden süzüldürün, aliquot ile 5 tüpe alın ve ardından -80 °C'de depolayın.
2. P1/7 suş biyofilm durum hücrelerinin koleksiyonu
   1. 20 ml gece kültüründen alın ve 180 mL taze THB ekleyin; Sulandırılmış kültürü eşit olarak 10 yuvarlak kültür plakasına böler ve ardından plakaları %5_CO2 içinde 37 °C'de 24 saat boyunca kuluçka kutusuna koyur.
   2. İnkubasyondan sonra, plakaya yapışmayan bakterileri yeniden süsküye almak için plakayı hafifçe sallayın ve ardından süpernatantı aspirasyonla atabilirsiniz.
      NOT: Plakayı nazikçe sallayın ve tortunu yeniden süzüldürmekten kaçının.
   3. Biyofilm durum hücrelerini toplamak için 5 mL PBS ekleyin, tortunu tamamen yeniden askıya alın ve ardından örneği yeni bir tüpe aktarın.
   4. Son adımdaki biyofilm durum hücrelerini aşağıdaki parametrelerle sonikleştirin: 60 W, 4 döngü, 5 saniye açık ve 10 saniye kapalı.
   5. 8000 × g'de 3 dakika santrifüj yapın ve süpernatantı -80 °C'de saklayın.
      NOT: Süpernatant biyofilm bileşenleri içerebilir ve hayvan deneylerinde (Adım 2) tanımlandığı gibi biyofilm bakterilerini enfeksiyondan önce yeniden süspansiyona almak için kullanılabilir.
   6. Tortu THB içinde 10 mL %25 gliserol ile yeniden süspansiyona alın ve ardından biyofilm durum hücrelerini -80 °C'de depolayın.

2. Hayvan Deneyleri

1. Bu çalışmada SPF ile 6 haftalık dişi BALB/C fareleri kullanıldı. Tüm fareleri, enjeksiyon bölgesi bregmadan 3,5 mm rostral uzaklıkta bulunan intrakraniyal subarachnoidal enfeksiyon yoluyla enfekte edin.
   1. Histopatolojik analiz için, planktonik hücreler veya biyofilm durum hücreleri kullanılarak iki fare grubunu (grup başına 5 fare) 3 × 10⁷ koloni oluşturan birim (CFU) dozda enfekte edildi ve başka 5 fareye kontrol olarak PBS enjekte edildi.
   2. Beyinde TLR2 ve sitokinlerin mRNA ekspresyonunun tespit edilmesi için, planktonik hücreler veya biyofilm durum hücreleri kullanarak 3 × 10⁷ CFU dozunda iki ek fare grubu (grup başına 6 fare) enfekte edilir.
   3. Canlı bakteri sayısını seri seyreltmeleri THA üzerine kaplama olarak belirleyin.
   4. Daha fazla araştırma için enfeksiyondan 12 saat sonra tüm fareleri ötenazi yapın. ​
      NOT: Stok ortamdaki gliserol, enfeksiyondan önce çıkarılmalıdır. -80 °C'den elde edilen hem planktonik hücreler hem de biyofilm durum hücreleri PBS ile 3 kez yıkanır. Daha sonra planktonik hücreler PBS ile yeniden süspansiyona alınır ve enfeksiyon için uygun dozda seyreltilir; Biyofilm durum hücreleri, depolanan süpernatantla (1.2.5. adımdan itibaren) yeniden süspansiyona alınır ve enfeksiyon için uygun dozda seyreltilir. Enfeksiyon hacmi 50 μL'den fazla olmamalıdır.
2. Beyin dokusunda TLR2 ve sitokinlerin mRNA ekspresyonunun tespiti
   1. Beyin dokusundan toplam RNA'yı RNA çıkarma kiti kullanarak çıkarın.
      1. Her fare için, RNA çıkarmak için tüm beyin dokusunu kullanın. Tüm beyin dokusunu 5 tüpe ayır. 100 mg'a kadar beyin dokusu alın ve kit tarafından sağlanan lizizasyon matrisini içeren her tüpe 1 mL liz çözeltisi ekleyin.
      2. Tüpü bir homojenizatorda 40 saniye boyunca 6.0 ayarında işleyin, ardından tüpü 12000 × g ve 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
      3. Santrifüjlemeden sonra üst faz yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarılır.
      4. Transfer edilen örneği oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka edin; 300 μL kloroform ekleyin, 10 saniye girdabda bırakın ve ardından oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka yapın.
      5. Tüpü 12000 × g ve 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Üst fazı yeni bir tüpe aktarın.
      6. Tüpe 500 μL soğuk mutlak etanol ekleyin, sonra 5 kez ters çevirin ve ardından örneği -20 °C'de en az 1 saat saklayın.
      7. Tüpü 12000 × g ve 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatantı çıkarın. Pelleti 500 μL soğuk %75 etanol ile RNase içermeyen suda (H₂O) yıkayın.
      8. Etanol çıkarılır, peleti oda sıcaklığında 5 dakika hava ile kurutabilir ve RNA'yı 100 μL RNase-içermeyen H_2Oile yeniden süzülür.
      9. RNA'yı oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka yapın ve RNA biyoanalizörü kullanarak RNA konsantrasyonunu belirleyin.
   2. Genomik DNA'nın (gDNA) eliminasyonu da dahil olmak üzere, ters transkripsiyon (RT) reaktif kiti olan bir termosikler kullanarak tamamlayıcı DNA (cDNA) sentezi gerçekleştirin.
      1. Hacmi 10 μL'ye ulaşana kadar 2 μL 5x gDNA eliminasyon tamponu, 1 μL gDNA eliminasyon enzimi ve RNazsız_{H 2}O içeren bir tüpe 1 μg RNA ekleyin. 42 °C'de 2 dakika kuluçka yapın.
      2. Son adımdan reaksiyon çözeltisine 10 μL master mix (1 μL RT enzimi Mix I, 1 μL RT Primer Mix, 4 μL 5x Buffer 2 ve 4 μL RNase-free_{H 2O}) eklenin ve ardından nazikçe karıştırın. Hemen RT reaksiyonuna geçin: 37 °C 15 dakika ve ardından 85 °C 5 saniye.
      3. SYBR RT-qPCR kiti ile bir Gerçek Zamanlı PCR makinesi kullanarak nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) analizini gerçekleştirin. 10 μL 2x enzim, 0,8 μL ön primer, 0,8 μL ters primer, 0,4 μL 50x ROX Referans Boya II, 2 μL cDNA şablonu ve RNase-free H_2Oekleyerek toplam hacmi 20 μL elde edin.
      4. Her örneği aşağıdaki termal parametrelerle üçlü olarak çalıştırın: 94 °C'de 30 s, 95 °C'de 5 saniyelik 40 çevrim ve 60 °C'de 34 saniye, son aşama 95 °C'de 15 saniye, 60 °C'de 1 dakika ve 95 °C'de 15 saniye. RT-qPCR için primerler Tablo 1'de listelenmiştir. Ev işleri genleri B2m ve 18s rRNA iç kontroller olarak kullanıldı.
   3. ^2-ΔΔCt yöntemine göre göreceli katlanma değişimini hesaplayın.

Tablo 1: RT-qPCR için primerler.

Giriş Adı	Dizisi (5'-3')	Gen sembolü
IL-6 forveti	CTTCCATCCAGTTGCCTTCT	Il6
IL-6 ters	CTCCGACTTGTGAAGTGGTATAG	Il6
TLR2 ileriye	CACTATCCGGAGGTTGCATATC	Özet2
TLR2 ters	GGAAGACCTTGCTTCTCTCTCTAC	Özet2
CCL2 forveti	CTCACCTGCTGCTACTCATTC	Ccl2
CCL2 ters	ACTACAGCTTCTTTTGGGACAC	Ccl2
TNF-α forette	TTGTCTACTCCCAGGTTCTCT	TNF
TNF-α ters	GAGGTTGACTTTCTCCTGGTATG	TNF
β2m ileri	GGTCTTTCTGGTGCTTGTCT	B2m
β2m ters	TATGTTCGGCTTCCCATTCTC	B2m
18'lik forvet	GTAACCCGTTGAACCCCATT	18s rRNA
18'ler ters	CCATCCAATCGGTAGTAGCG	18s rRNA

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Todd Hewitt Broth (THB)	Becton, Dickinson ve Şirketi	DF0492078	30 g tozu 1 litre saflaştırılmış suda çözürün. 121°'de 15 dakika boyunca otoklav yapın.
Agar	DSBIO	16C0050	15 g tozu 1 L THB'de çöz. 121°'de 15 dakika boyunca otoklav yapın.
Milli-Q Referans Su Arıtma Sistemi	Merck KGaA	Z00QSVCUS	Dnase/Rnase olmadan
NaCl	Tianjin Kemiou Kimyasal Reaktif Şirketi, Ltd	10019318
Na₂HPO₄	Xilong Bilimsel Şirketi, Ltd	9009012-01-09
KCl	Xilong Bilimsel Şirketi, Ltd	9009017-01-09
KH₂PO₄	Xilong Bilimsel Şirketi, Ltd	9009019-01-09
KOH	Xilong Bilimsel Şirketi, Ltd	9009014-01-09
Gliserol	Sionpharm Kimyasal Reaktif Şirketi, Ltd	10010618	Eşit hacimde saflaştırılmış su ile seyreltilmiş, 121° sıcaklıkta 15 dakika otoklav
%4 paraformaldehit	Sionpharm Kimyasal Reaktif Şirketi, Ltd	80096675
%25 Glutaraldehit	Sionpharm Kimyasal Reaktif Şirketi, Ltd	30092436	10 kat arıtılmış suyla seyreltilmiş, fiksasyon için.
Etanol	Sionpharm Kimyasal Reaktif Şirketi, Ltd	10009218
Kloroform	Sionpharm Kimyasal Reaktif Şirketi, Ltd	10006818
Spctrophotometre	DeNovix Inc.	DS-11+
Ultrason hücre kırıcı	NingBo Scientz Biyoteknoloji A., Ltd	JY96-IIN
Santrifüj	Hitachi Koki Co., Ltd	CT15RE
Buzdolabı	Aucma Co., Ltd	DW-86L500
FastRNA Pro Yeşil Kit	MP Biyomedikal	#6045-050
FastPrep-24 Enstrüman	MP Biyomedikal	116005500
PCR için Cihaz	SensoQuest GmbH	1124310110
QuantStudio 6 Flex	Thermo Fisher Scientific	4485689
SYBR Premix Ex Taq II	Takara Biyomedikal Teknoloji (Pekin) Şirketi, Ltd	RR820A
PrimeScript RT reaktif kiti gDNA Eraser ile	Takara Biyomedikal Teknoloji (Pekin) Şirketi, Ltd	RR047A