Bu video, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) aerosol olarak farelere aerosol olarak ulaşımı ve nebulizator tabanlı bir oda sistemi kullanılarak akciğer enfeksiyonu indükte göstererek, havadan tüberküloz iletimi ve konak-patojenler etkileşimlerini in vivo incelemek için kontrollü ve tekrarlanabilir bir model sunmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Fare modelinde Mycobacterium tuberculosis'in akciğer enfeksiyonu için aerosol iletimi
638 görüntülenme
⸱
2 Şubat 2026
Bu makalede
Özet
Protokol
Hayvan modelleriyle ilgili tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından incelenmiştir.
1. Glas-Col Aerosol Odası kullanılarak farelerin Mtb ile aerosol enfeksiyonu
Mtb (Mycobacterium tuberculosis) ile deneysel hayvanlarda aerosol enfeksiyonunu standartlaştırmanın en iyi yolu, bilinen CFU (koloni oluşturan birimler) titrelerine sahip donmuş stoklardan mikobakteriler kullanmaktır. Stok kültürleri hazırlamak için, Middlebrook 7H9 çorbasında Mtb kültürü yapılır; OADC (Oleik asit, Alyumin, Dekstroz, Katalaz) zenginleştirme ortamı ve mikobakteriler için karbon kaynağı olan %0,05 Tween 80 ile takviye edilir ve aynı zamanda bakteriyel topaklanmanı önlemek için önlemler alınır. Kültürlerin hasat anında OD (optik yoğunluk) ≤ 1 olmalıdır. Yüksek OD'de bakteriyel topaklanma artar ve canlılık azalır. 1 ml aliquotları -80 °C'de depolayın. Donmuş stoklarda canlı CFU sayısını, %0,5 gliserol, 1 g/L asparagin ve OADC ile takviye edilen 7H11 agar plakalarına üç bağımsız şişenin 10 kat seyreltme serisi yerleştirerek ve 37 °C'de 4 haftalık kuluçkadan sonra kolonileri sayarak belirleyin. Aşağıda tarif edildiği gibi aerosol enfeksiyonu gerçekleştirin.
- Bilinen CFU titrine sahip Mtb stoklarını eritin ve 27 G iğneyle takılmış 1 ml entrenge ile bakteri kümelerini dağıtmak için süspansiyonu beş kez dikkatlice karıştırın. Aerosol üretiminden kaçının.
- İstenen enfeksiyon dozuna bağlı olarak, gerekli mikobakteriyel stok hacmini steril fosfat-tamponlu salin (PBS) içeren 50 ml'lik bir tüpe aktarın. Son hacim 6 ml.
NOT: Bu süspansiyondaki mikroorganizma sayısını değiştirerek, aerosol damlaları taşıyan bakteri oranı değiştirilir. Genellikle akciğer başına 100 canlı basil almayı hedefliyoruz (düşük dozlu enfeksiyon). Deneyimimize göre, bu yaklaşık 1-2 × 10adet 6 Mtb/ml toplam 6 ml hacimde gerektirir ve bunun 5,5 ml'si nebulize edilmiştir. Enfeksiyonunuz için ideal koşulları bulmak amacıyla farklı bakteri konsantrasyonlarıyla bir dizi deneysel aerosol meydan okuması yapmanız önerilir. 5.000'e kadar mikobakteri içeren yüksek dozlu enfeksiyonlar enfeksiyon sürecini hızlandırabilirken, fareleri aerosol ile enfekte etmek için sadece 5 bakteri bile kullanılabilir. Enfeksiyon oranı genellikle %100'dür.
- Inaşılum titresini belirlemek için kaplama için yeterli hacmi (son hacmden fazla hazırlanmış) çıkarın; Genellikle 500 μl Technical Triplicate'den plaka çıkarıyoruz.
- Hayvanları, dairesel aerosol odasının içinde bölmeli bir ağ sepete (her sepette bir fare) yerleştirin ve aerosol odasının kapağını kapatın.
NOT: Diğer modeller, her biri 20 fare sığdırabilen beş ayrı bölmeden oluşan turta şeklinde bir sepetle donatılmıştır.
- Venturi-nebulizer ünitesini üç paslanmaz çelik soket eklemine takın.
- 50 ml'lik tüpten mikobakteriyel süspansiyonu, 18 G'lik küt iğne ile 10 ml'lik bir şırınga ile çıkarın ve şırıngayı kapalı bir taşıma kutusunda aerosol odasına taşıyın.
- Nebulizer ünitesinin vida kapağını çıkarın ve mikobakteri süspansiyonunu dikkatlice nebulizatora enjekte edin. Aerosol oluşumundan kaçının. Şırıngayı %2 Buraton içeren bir keskin kaba atın. Nebülizatörü vida kapağıyla kapatın.
- Ana güç anahtarını ve UV lambayı aç. Kontrol tuş takımındaki ekranda "Glas-Col Apparatus Co" yazıyor.
- Program düğmesini açın. Ekranda "Nebulizer hazır mı?" "Sepet dolu mu?" Hazır olduğunda enter tuşuna bas" gösterecek. Enter tuşuna bas.
- Ekranda "Preheat Time 900 Girin" yazıyor; Bu, yakma cihazının (egzoz havasını dezinfekte eden) ön ısıtma süresinin 900 saniye olduğu anlamına gelir. Enter tuşuna basın.
- Ekranda "Nebulizasyon Süresi 1.800 Gir" gösterilecek; Bu, nebulizasyon süresinin varsayılan olarak 1.800 saniye olarak ayarlandığı anlamına gelir. Bulbulizasyon süresini uzatmak için "2.400" yazın ve enter tuşuna basın.
NOT: Nebulizasyon döngüsü sırasında, basınç altındaki hava süspansiyonu atomize eder ve böylece mikobakteri içeren küçük aerosol damlacıkları oluşturur. Ana hava akışıyla birlikte, bu damlacıklar (yaklaşık 2-5 μm büyüklüğünde) aerosol odasına taşınır.
- Ekranda "Enter C.D. Time 1.800" yazacak; Bu, çürüme döngüsünün 1.800 saniye sürmesi anlamına gelir. "2.400" olarak ayarlayın ve Enter tuşuna basın.
NOT: Bu döngü boyunca, nebulizasyon döngüsü sırasında aerosol odasında biriken bulut bozulabilir. Küçük damlacıklar deneysel hayvanlar tarafından solunur.
- Ekranda "Aralık Saati 900'ü Girin" gösterilecek; bu, UV ışığı dekontaminasyon döngüsünün 900 saniye süreceği anlamına gelir. Enter tuşuna basın. Makine, ön ısıtma, nebulizasyon, bulut bozunması ve UV dekontaminasyonu döngüsüne başlar.
DIKKAT: Vakum akış ölçeri saatte 60 fit küp göstermelidir (ön ısıtma döngüsü başladığında kontrol olun; gerekirse vakum kontrol valfini ayarlayın) ve sıkıştırılmış hava akış ölçeri 10 fit küp/saat (nebulizasyon döngüsünün başladığında kontrol edin; hava kontrol valfini buna göre ayarlayın). - Döngü tamamlandığında, tuş takımı "Süreç Tamamlandı – Numuneyi Çıkar" gösterecek. Programı, UV'yi ve ana güç anahtarını kapatın.
- Mikobakteriyel süspansiyonun tamamen nebülize olup olmadığını kontrol edin, eğer yapılmadıysa, kalan hacmi 18 G'lik bir künt iğne takılmış uygun bir şırıngayla dikkatlice çıkararak kaydedin. Kalan hacim 1 ml'den fazla olmamalıdır.
- Nebulizeri eklemlerden çıkarın ve %2 Buraton içeren bir tavaya en az 2 saat koyun, genellikle dezenfeksiyon O/N yapılır. Sonrasında nebulizatoru taze bir tavaya taşıyın ve iyice suyla durulayın. Nebulizatoru hava kurumasına bırakın.
- Aerosol odasını açın ve hayvanları kafeslerine geri götürün. Sepetleri otoklav torbalarına ve otoklavlara koyun. Aerosol odasının iç yüzeylerini %2 Buraton ile temizleyin.
NOT: Güvenlik nedenleriyle, bu işlem sırasında elektrikli hava temizleyici solunum cihazı takılmalıdır.
- Kalan 500 μl mikobakteriyel süspansiyon kullanılarak (bkz. adım 1.3), 7H11 agar plakalarında teknik üçlü (3 x 100 μl) bir üçlü tablet 10 kat seyreltme yapıldı.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Buraton | Schülke | Aktif bileşenler: aldehitler (formaldehit, glutaraldehit, oksalaldehit, etil heksanal) | |
| Middlebrook 7H9 | Sigma | M0178 | Mtb et suyu kültürleri için |
| Middlebrook 7H11 | BD Biosciences | 283810 | Mtb kültürü için Agar ortamı |
| Middlebrook OADC zenginleştirme ortamı | BD Biosciences | 212240 | Mtb kültürü için 7H9 ve 7H11'e ek edin |
| Soluma Maruziyet Sistemi | Glas-Col | ||
| Nebulizator-Venturi | Glas-Col |
