Farelerde Bakteriyel Enfeksiyonların Biyolüminesans Görüntülemesi

Özet

Kaynak: de Vries, C. R. ve ark., Kronik Pseudomonas aeruginosa Yara Enfeksiyonunun Gecikmiş Aşılama Modeli. J. Vis. Exp. (2020).

Bu video, canlı bir fare modelinde bakteriyel enfeksiyon ilerlemesini izlemek için biyolüminesans görüntüleme tekniğini gösteriyor. LuxABCDE raporlayıcı sistemiyle tasarlanmış patojenik bakteriler, enfeksiyon bölgesinde ışık yayarak metabolik olarak aktif bakterilerin görselleştirilmesini sağlar. Araştırmacılar, fareyi zamanla görüntülemekle, enfeksiyon dinamiklerini invaziv olmayan şekilde takip edebilir ve biyolüminesans sinyal yoğunluğunu niceliklerini ölçebilmektedir.

Protokol

1. Bakterilerin hazırlanması ve büyümesi

1. Araştırmacının kurumsal biyogüvenlik komitesi ve hayvan kullanım komitesi rehberlerine uygun olarak P. aeruginosa ve BSL-2 önlemleri alan hayvanlarla ilgili tüm çalışmaları yürütün. Burada açıklanan P. aeruginosa ile ilgili tüm adımları, fare aşısı dahil, biyogüvenlik dolabında yapın.
2. P. aeruginosa'nın parlak PAO1:lux suşu, talep üzerine laboratuvarımızdan temin edilebilir. Streak PAO1, donmuş gliserol stoku olarak, Lizogeni Bulbarı (LB) agar üzerinde depolanmıştır. Luminesan PAO1:lux suş için, LB agar seçici antibiyotikler (100 μg/mL karbenisilin ve 12,5 μg/mL kanamisin) içermelidir. Bakteri kuluçka makinesinde gece boyunca 37 °C'de yetiştirin.
3. İzole bir koloni seçin ve 3 ml LB ortamda, pH 7.4 içinde 37 °C'de gece boyunca büyüyün. Lüminesans suşlar için, et suyu 100 μg/mL karbenisilin içermelidir. Titreme, aerobik koşullarda yetiştir.

2. İşlem hazırlığı

1. Ameliyat yapan tüm personelin temiz bir önlük/laboratuvar önlüğü, maske, saç ağı ve eldiven takmasını sağlayın.
2. Makas ve pens dahil tüm cerrahi aletleri otoklavla inceleyin. Aletleri hayvanlar arasında sterilize etmek için aseptik teknik kullanın.
3. Ameliyat masasını etanol ile temizleyin ve temiz bir cerrahi alan hazırlayın.

3. Tüy alma

1. 8–12 haftalık C57BL/6J farelerini %1–3 izofluran kullanarak anestezi edin. Araştırmacılar, izofluran kullanırken kurumlarının veteriner personeli anestezi yönergelerine uymalıdır.
   1. Anestezi %1–%3 isofluran vererek başlayın ve oksijen akış hızını 1,5 L/dakika'ya ayarlayın. Fareyi indüksiyon odasına yerleştirin.
   2. Anestezi derinliğini değerlendirmek için farenin parmağını sık. Fare artık uyarıma yanıt vermediğinde, onu indüksiyon odasından çıkarıp cerrahi tezgahın üzerine yerleştirilin, burnu izofluran burun konisine yerleştirilir.
   3. Her iki göze göz kayganlaştırıcısı uygulayın.
2. Prosedür öncesi temel bir kilo almak için fareyi tartın.
3. Fareyi yatağa koyun. Fareyi deri altına önceden ısıtılmış steril %0,9 sodyum klorür, her yanda 250 μL enjekte ederek toplamda 500 μL elde edin.
4. Farenin sırt bölgesini elektrikli tıraş makinesiyle tıraş edin. Tıraş işlemi, yaranın saç kontaminasyonunu önlemek için cerrahi istasyondan farklı bir yerde yapılmalıdır.
5. İnce bir tabaka tüy çıkarma losyonu uygulayın. Losyonu 20–60 saniye bekletin. Tüyleri ve fazla losyonu ılık suyla nemlenmiş gazlı bezle çıkarın. Tüy çıkardıktan sonra eksizyon yaralama işlemine geçin.

4. Tam kalınlıkta eksizyon yara ameliyatı

1. Farenin orta sırt bölgesine 25 G'lik bir iğne kullanarak 0,6–1 mg/kg sürekli salınımlı buprenorfin enjeksiyonu yapılabilir. Yavaş salınımlı buprenorfin 48–72 saat boyunca ağrı giderici sağlar.
2. Ameliyat bölgesini dezenfekte edin. Sırt yüzeyini steril bir betadin sürüntüsüyle silin. Fazla Betadine'i steril alkol sürüntüsüyle silin. Bunu 3 kez (betadin ve alkol arasında dönüşümlü olarak) yapılmalıdır; ortadan kenara dairesel şekilde hareket ederek sürüntü yapılmalıdır. Bölgenin hava ile kurumasına izin verin.
3. Ameliyat bölgesinin etrafında steril gazlı bez veya plastik yapışkan sargı ile bir perde oluşturun.
4. Cilt gergin şekilde kaudal olarak gerilsin. Sol dorsal epidermiste ilk kesi yapmak için steril 6 mm çapında bir cilt biyopsi punchu kullanın. Sağ dorsal epidermiste tekrarlayın.
5. Sol konturlu yara alanının ortasından deriyi penseps ile çadır ile kapatın. Epidermal ve dermal katmanları makasla kesin. Sağdaki konturlu yara alanında simetrik eksizyon yaralar oluşturmak için tekrarlayın.
6. Yaraları 50 μL steril salin ile yıkayın. Ameliyat bölgesi ve çevresindeki cildin hava ile kurumasına izin verin. Sonra yaraları ve dorsumu şeffaf bir film pansmanı ile kapatın.
7. Faresi temiz bir kafese geri koy. Her kafeste 1 hayvan ev.
8. Kafesi bir ısıtma pedine koyun ve fare uyanana kadar izleyin.
9. Yukarıdaki ameliyatı birden fazla hayvan üzerinde yaparken, hayvanlar arasındaki tüm cerrahi aletleri temizlemek için sıcak boncuk sterilizatörü kullanın.
10. Bakteri aşılamadan önce farelerin cerrahi işlemden iyileşmesi ve yaralar üzerinde geçici bir yara matrisi oluşması için 24 saat beklen.

5. P. aeruginosa ile aşılama

1. Gece boyunca PAO1:lux kültürünü OD600 = 0.05'e kadar seyreltin, 100 μg/mL karbenisilin içeren 75 mL LB ortamında ve kültür erken üstel aşamaya (_{OD 600} ≈ 0.3) gelene kadar büyütün. Bu yaklaşık 2–3 saat sürecektir.
2. PAO1: lux PBS'yi (7.5 ± 2.5) x 10² CFU/mL konsantrasyonuna kadar seyreltirin. Deneyden sonra yeterli hacim ve kaplama için fazla inokulum hazırladığınızdan emin olun. Tesisler arasında (örneğin, laboratuvardan vivariuma) taşıma yaparken, açıkça belirtilmiş Biyotehlike ile işaretlenmiş sızdırmaz bir kutuda çift muhafaza kullanın.
3. P . aeruginosa ve farelerle ilgili tüm çalışmaları, Hayvan Biyogüvenliği Seviye 2 (ABSL-2) onaylı biyolojik güvenlik kabinesinde (BSC) onaylanmış kişisel koruyucu ekipman kullanarak gerçekleştirin. Tartı gibi yeniden kullanılabilir ekipmanlar, kontaminasyonu önlemek için yapışkan sargıyla kaplanmalıdır.
4. Yukarıda açıklandığı gibi %3 izofluran kullanarak anestezi yapın. Fareyi tartın ve ağırlığı kaydedin. Fareyi deri altına önceden ısıtılmış steril %0,9 sodyum klorür, her yanda 250 μL enjekte ederek toplamda 500 μL elde edin.
5. Farenin şeffaf film pansiyası gece boyunca döküldüyse, oluşan kabuğu dikkatlice çıkarın ve yeni bir pansman takın.
6. Her yaraya şeffaf film sargısı aracılığıyla 40 μL PAO1:lux süspansiyon enjekte etmek için 500 μL tüberkülin 27 G güvenlik kapağı şırıngası kullanın. Karşı taraftan çapraz kontaminasyonu önlemek için aşılanmamış/PBS yara kontrolleri için farklı fareler kullanılmalıdır.
7. Fareyi kafesine geri bir ısıtma pedine yerleştirin ve uyanana kadar izleyin. Tüm fareler, çapraz kontaminasyonu önlemek için ayrı kafeslerde ayrı ayrı olarak tutulmalıdır.
8. Kafesin zeminindeki yiyecek pelletleri arasına sıkıştırılmış yüksek kalorili bir besin takviyesi macunu ekleyin.
9. Kalan inokulumu kullanarak bir LB agar plakasını çizerek çizebilirsiniz. Uygulanan bakteri sayısını doğrulamak için koloni sayın.

6. Enfekte yaraların in vivo görüntülemesi

1. Farelerin görüntüleme cihazına taşınması için BSL-2 muhafaza protokollerini takip edin; ikincil bir kap kullanımı da dahil. Fare indüksiyon odasına veya görüntüleme cihazına aktarılırken hayvan yataklarını transfer etmemeye veya düşürmemeye dikkat edin.
2. İndüksiyon odasında %1 – %3 isofluran inhalasyonu ile farenin anestezisini indükleyin.
3. Fare anestezi edildikten sonra, burun izofluran burun konisinde olurken, optik görüntüleme sisteminin görüntüleme odasına yatan pozisyona yerleştirilin.
4. Yazılımı açın.
5. Alım parametreleri, aynı anda görüntülenen hayvan sayısına ve biyolüminesans yoğunluğuna göre değişecektir. Ayarlanacak temel parametreler arasında pozlama süresi, binning, f/stop ve görüş alanı (FOV) bulunur. Varsayılan başlangıç ayarlarımız pozlama süresi 30 saniye, binning low (2), f/stop 1.2 ve FOV 25. Bu ayarları araştırmacının ihtiyaçlarına göre ayarlamak gerekir.
6. Bir görüntüleme programı kullanarak lüminesans verilerini analiz edin. Lüminesans, farelerin renkli fotoğrafının üzerine yerleştirilmiş bir sözde renkli görüntü olarak temsil edilecektir.
   1. Yara bölgesinde ilgi çekici bir bölge (ROI) oluşturun ve tespit edilen ortalama akı (foton/saniye) ölçün. Verilerin ışılma olarak da bildirilebileceği (foton/saniye/cm²/steradian), ancak görüntüleme platformunun kameradan uzaklığı görüntüleme arasında sabit kalınca, akı yeterlidir.
   2. Arka planı, görüntüleme platformunda rastgele bir bölgede bir yatırım getirisi oluşturarak ölçün. Arka plan foton sayısını saniyede çıkarın.
   3. Verileri daha fazla analiz için bir elektronik tabloya aktarın.
7. Yukarıda tarif edildiği gibi görüntüleme yaparak enfeksiyon ilerlemesini takip etmek için günlük olarak sıkça yapılabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
%0,9 Sodyum klorür enjeksiyonu	Hospira	2484457
18 G x 1 steril iğne	BD	305195
25 G x 1 1/5 steril iğne	BD	305127
Alkol sürüntü	BD	326895
Aura Görüntüleme Yazılımı	Spektral Aletler Görüntüleme	N/a
Betadine	Purdue Frederick Şirketi	19-065534
Buprenorfin SR LABORATUVARI	Zoopharm	N/a
C57BL/6J erkek fareler	Jackson Laboratuvarı	664
Tek kullanımlık biyopsi punch, 6mm	Integra	33-36
İnce makas - Tungsten Karbid	Güzel Bilim Araçları	14568-09
Cam boncuk kuru sterilizatör	Harvard Aparatı	61-0183
Granüllü Agar	Fisher Biyoreaktifleri	BP9744
Isıtma Pedi	Milyar	804879481218
28 G iğneli insülin şırıngası	BD	329461
Lago X Görüntüleme Sistemi	Spektral Aletler Görüntüleme	N/a
LB suyu	Fisher Biyoreaktifleri	BP1426
Leur-Lok 1 mL şırınga	BD	309628
Mini Arco Hayvan Trimmer	Wahl Profesyonel	919152
Bebek Yağı Olan Nair Tüy Alma Losyonu	Church ve Dwight	N/a	Her eczanede bulunabilir
Sekizgen Penseps	Güzel Bilim Araçları	11041-08
Petri kabı	Falcon	351029
Fosfat Tamponlu Salin (PBS) 1x	Corning	21-040-CV
Pres ve Mühürleme Örtülü Ambalaj	Memnun oldum	N/a
SafetyGlide 30 G iğneli insülin şırıngası	BD	305934
Safetyglide İnsülin şırıngası, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TW	BD	305934
Ölçek	Ohaus İzci Pro	SP202
Supplikal Beslenme Takviyesi	Henry Schein Hayvan Sağlığı	29908
Tegaderm, 6 cm x 7 cm	3M	1624W