Bitki RNA Susturmasını Bastıran Patojen Efektörlerinin Taraması için Ortak İnfiltrasyon Testi

Özet

Kaynak: Shi, J. ve diğerleri. Bitki Patojenlerinin Salgılanan Efektörlerinden RNA Susturucu Baskılayıcıların Taraması ve Tanımlanması. J. Vis. Exp. (2020)

Bu video, Nicotiana benthamiana 16c'de RNA susturmasını baskılayan patojen efektör proteinlerini tanımlamak için bir ortak infiltrasyon testini göstermektedir. Floresan bir raporlayıcı ve aday efektör gen, Agrobakteriya aracılığıyla bitki yapraklarına aktarılır. Normalde, RNA susturması raporlayıcı transkriptleri bozur ve floresansı azaltır. Supresör efektörleri bu yanıtı engeller ve floresansı korur. Bu test, konak savunmasını engelleyen mikrobiyal efektörleri taramak için hızlı ve görsel bir yöntem sunar.

Protokol

Ortak sızma Nicotiana benthamiana yaprakları

1. 35S-GFP içeren eşit hacimli Agrobakteriyel kültürün, 35S-salatalık mozaik virüsü baskılayıcı 2b (CMV2b), varsayılan efektör veya boş vektör (EV) içeren Agrobakteriyel kültürü ile karıştırın.
2. N. benthamiana 16c yapraklarının abaksiyal taraflarındaki karışık agrobakteriyel süspansiyonları dikkatlice ve yavaş bir şekilde 1 mL iğnesiz bir şırınga ile sızdırın.
3. Kalan bakteri süspansiyonunu yapraklardan yumuşak doku sileceklerle çıkarın ve sızan yamaların kenarlarını maker kalemiyle dairesel yapın.
4. Sızan bitkileri aynı büyüme koşulları altında büyüme odasında bırakın.
   
   NOT: Güvenlik ve sağlık nedenleriyle, sızma sırasında koruyucu gözlük ve maske takılmalıdır. Çapraz kontaminasyonu önlemek için, eldivenler infiltrasyonlar arasında etanol ile değiştirilmeli veya sterilize edilmelidir. Genellikle infiltrasyon için yaprak başına en az 1 mL agrobakteriyel süspansiyon gereklidir. Sistemik susturma için, sızma için en az iki yaprak gereklidir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
UV lamba	Analytik Jena	UVP B-100AP	Gözlem