Sivrisinek Midgutundan Bakterilerin İzolasyonu

Özet

Kaynak: Liu, X. ve diğerleri. Antibiyotikle aranmış sivrisineklerle bakteriyel ağız beslenme testi. J. Vis. Exp. (2020)

Bu video, sivrisinek midgutunun bağırsak bakterilerini izole etmek için diseksiyonunu gösteriyor. Midgut, sindirim sisteminden çıkarılır, bakterileri serbest bırakmak için homojenleştirilir ve besin agara kaplanır ve bakteri kolonileri kültürlenir.

Protokol

1. Sivrisinek mid-bağırsağını kesin
   1. Yüzeyden sterilize edilmiş sivrisinekleri steril 1x fosfat-tamponlu tuzlu (PBS) tampon damlası ile cam kaydırmaya aktarın. Diseksiya mikroskobu altında disseksiya yapın.
   2. Disseksiyon mikroskobunun alt büyütme altında, sivrisineklerin bacaklarını, kanatlarını ve başını dikkatlice çıkarın ki kaçmasını önleyin. Sindirim sisteminin kırılmasını önlemek için sivrisinek son somitini çekerek doğrudan keserek çıkarın.
   3. Sivrisineklerin göğsüne ve karın ucunu pensle kelepçe. Sivrisineklerin sindirim sistemini nazikçe çıkar. Edinilen sindirim sistemi genellikle bitki, ön bağırsak, orta bağırsak, arka bağırsak ve Malpighian tüplerini içerir.
   4. Disseksiyon mikroskobunu daha yüksek büyütmeye ayarlayın. Kesilmiş sindirim sisteminden mahsul, ön bağırsak, arka bağırsak ve Malpighian tüplerini çıkararak sivrisineklerin orta bağırsağını elde edin.
   5. Ürünü çıkarırken dikkatli olun, çünkü sivrisinek şekerli bir yemek yedikten sonra ürün şişir ve bağırsağı andırır. Malpighian tüpleri, uzun ve ince dışkı tüplerinden oluşan bir grup olup, orta bağırsak ile arka bağırsak arasındaki sınırda yer alır.
2. Bağırsak bakterilerini izole et
   1. Diseksiyon edilen midgutu, 200 μL steril 1x PBS tamponu ile steril 1,5 mL bir tüpe aktarın.
   2. Bağırsak bakterilerinin tampona tamamen salınmasını sağlamak için steril bir tezgahta steril bir tezgahta iyice öğütün.
   3. Homojenatı seri olarak üç adet 10 katlık seyreltme ile seyreltirin. Her seyreltmeden 50 μL LB (Luria çorbası) agar tabağına ekleyin ve tabağa yayın. Eğer midgut yüksek bir konsantrasyon bağırsak florası içeriyorsa, tek kolonileri seçmek için daha fazla seri seyreltme yapmak gereklidir.
   4. Plakayı 37 °C'de 1–2 gün boyunca kuluçkalayın, ta ki tek koloni görünene kadar.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Aedes aegypti			Dişi sivrisinekler
Santrifüj tüpü	Sangon Biyoteknoloji	F601620-0010	1.5 mL, Doğal, dereceli, steril
Tek kullanımlık doku öğütme havanı	Sangon Biyoteknoloji	F619072-0001	70 mm Uzun, konik, mavi, steril
Forseps	RWD	F11029	Diseksiyon
LB agar tozu	Sangon Biyoteknoloji	A507003	Tripton 10.0 g, maya ekstraktı 5.0 g, NaCl 10.0 g, Agar 15.0 g.
Mikroskop	Zeiss	Stemi508
10X PBS tamponu	Sangon Biyoteknoloji	E607016	Bu ürün 10X çözümdür. Lütfen kullanmadan önce 10 kez seyreltin. pH değeri 7.4'tür.