Yetişkin sivrisineklerde tanımlanmış bir bağırsak bakteri popülasyonu oluşturmak

Özet

Kaynak: Liu, X. ve diğerleri. Antibiyotikle aranmış sivrisineklerle bakteriyel ağız beslenme testi. J. Vis. Exp. (2020)

Bu video, antibiyotik içeren bir sukroz çözeltisi kullanarak sivrisineklerde doğal bağırsak mikrobiyotasının tükenmesini göstermektedir. Bunu izlemek, sivrisinek bağırsağında tanımlanmış bir bakteri popülasyonu oluşturmak için membran besleme sistemi aracılığıyla bakteriyel askıma ile kontrollü yeniden kolonizasyon yapılır.

Protokol

1. Antibiyotik tedavisi ve bakteri yeniden girişi

1. Antibiyotik çözeltisini hazırlayın.
   1. Gerekli miktarda sukroz, penisilin ve streptomisin tartarak 20 birim penisilin ve 20 μg streptomisin içeren %10 sakaroz çözeltisi hazırlanın.
2. Sivrisinekleri antibiyotik çözeltisiyle besleyin.
   1. Sivrisinekleri 4 °C'de 3–5 dakika boyunca anestezi altına alın. Sivrisinekleri kağıt bardağa aktarın. Üstünü gazlı bezle kapatın ve sivrisineklerin kaçmasını önlemek için gazlı bezi bantla kapatın.
   2. Steril pamuk toplarını antibiyotik çözeltisine batırın ve dikkatlice sivrisinek kabına yerleştirin. Sivrisineklerin islanmış pamuk toplarında boğulmasını önlemek için pamuk toplarını kullanmadan önce sıkın.
   3. Pamuk toplarını nemin buharlaşmasını önlemek için 10 cm Petri kabı ile kaplayın. Pamuk toplarını üç gün üst üste günde iki kez değiştirin.
3. Bakteriyel süspansiyon hazırlanması
4. Bakteriyel çözeltiyi spektrofotometre ile ölçün. 1 mL'lik bir tüpe 1 OD (OD₆₀₀₀) bakteri süspansiyonu ekleyin. Süspansiyonu 5.000 x g ile 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın.
5. Üst sıvıyı atın ve süspansiyon çökeltmesi için 1,5 mL'lik bir tüpe 1 mL steril 1x PBS tamponu ekleyin.
6. 5.000 x g sıcaklıkta 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj; Süpernatantı at.
7. 2.4.2 ve 2.4.3 adımlarını tekrarlayın.
8. Bakteri çökelmesine 200 μL steril 1x fosfat-tamponlu tuzlu (PBS) tampon ekleyin.
9. 600 μL %10 sakaroz çözeltisi, 200 μL 10 mm adenozin 5′-trifosfat (ATP) (fagostimulyatör olarak görev yapan) ve 200 μL bakteriyel süspansiyon 1,5 mL steril bir tüpe eklenin. Vortex ile karıştırın.
10. Sivrisinekleri bakteri süspansiyonu ile besleyin.
    1. Sivrisinekleri 24 saat aç bırakın, böylece antibiyotiklerin metabolize olmasından önce bakteri beslemesini sağlar.
    2. Membran besleme sistemini birleştirin.
    3. Sterilize edilmiş besleyici üniteyi parafilm veya alternatif olarak bir kolajen membranı ile mühürleyin.
    4. Plastik bir halka takın ve besleme sırasında sürtünme nedeniyle kırılmaması için parafilm ile sabitleyin.
    5. Hazırlanan bakteri çözeltiyi yavaşça besleyici üniteye ekleyin.
       Not: İki kuyu besleme ünitesinin yalnızca bir kuyusu, çözeltiyle doldurulabilir ve besleyici üniteyi yalnızca reaktif düşürme tarafından kaplayabilir.
    6. Besleyici ünitesini, sivrisinekleri çekmek için insan sıcaklığını simüle eden 37 °C'ye önceden ısıtılan bir besleme sistemine bağlayın. Besleme cihazını sivrisineklerle dolu bir kağıt bardağın üzerine yerleştirin ve 90 dakika boyunca besleyin.
    7. Beslenmeden sonra, sivrisinekleri 4 °C sıcaklıkta 3–5 dakika boyunca anestezi altına alın ve sivrisinekleri buz gibi bir Petri kabında anestezi altında tutun.
    8. Daha fazla araştırma için tamamen şişmiş sivrisinekleri seçin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Adenosin 5′-trifosfat disodyum tuzu hidrat	Sigma	A2383	Adenosin 5′-trifosfat disodyum tuz hidrat, adenozin trifosfat (ATP) standart çözeltilerinin hazırlanmasında kullanılmıştır
Hemotek zar besleme sistemi	Hemotek		Besleme sisteminin bileşenleri, Hemotek sıcaklık kontrolörü, besleyici-yuva montajı, metal besleyici montajı.
Parafilm	Sangon Biyoteknoloji	F104002	4 in x 125 ft
Petri kabı	Sangon Biyoteknoloji	F611203
Penisilin G prokain tuzu hidrat	Sangon Biyoteknoloji	A606248	Beyaz toz. Suda çözünür, metanolde çözünür, suda hafifçe çözünür, etanol
Streptomisin sülfat	Sangon Biyoteknoloji	A610494	Streptomisin sülfat, prokaryotik proteinlerin sentezini engelleyen bir glukozamin antibiyotiğidir.
Sucrose	Sangon Biyoteknoloji	A502792	Suda, etanolde ve metanolde çözünür, gliserol ve piridinde hafifçe çözünür.
10X PBS tamponu	Sangon Biyoteknoloji	E607016	Bu ürün 10X çözümdür. Lütfen kullanmadan önce 10 kez seyreltin. pH değeri 7.4'tür.