Zebrafish embriyolarında mikobakteriyel enfeksiyon sırasında makrofaj hücre ölümünün canlı görüntülemesi

Bu makalede

Özet

Kaynak: Niu, L. ve diğerleri. Zebrafish embriyolarında mikobakteriyel enfeksiyon sırasında makrofaj litik hücre ölümünün intravital mikroskopi ile görselleştirilmesi. J. Vis. Exp. (2019)

Bu video, Mycobacterium marinum enfeksiyonu sonrası zebrafish embriyolarında makrofaj litik hücre ölümünü görselleştirmek için intravital konfokal mikroskopi kullanımını göstermektedir.

Protokol

1. Enfeksiyonun canlı görüntülenmesi

1. Canlı görüntüleme için balık montajı
1. Tricaine anestezi edilmiş 10 embriyoyu cam tabanlı 35 mm kabin ortasına transfer edin. Ekstra E3 orta seviyeyi at.
2. Tabağı %1 düşük erime noktası agarozu ile kaplayın ve zebrafish embriyolarını 10 G'lik bir iğneyle dikkatlice yönlendirin. Agarozun katılaşması için cam taban kabını buz üzerinde 10 saniye inkübe yapın.
  NOT: Orta beyin enjeksiyonu için embriyolar agaroza yerleştirilmeli ve başı yukarıya doğru yönlendirilmelidir (Şekil 1A).
3. Tamamen katılaştıktan sonra, agarozu yumurta suyu tabakası ile (1 x trikain ve PTU (N-feniltiorea)) ile kaplayın.
Üç renkli yüksek çözünürlüklü zaman geçişli konfokal mikroskopi
NOT: Aşağıdaki adımlar, 63.0x 1.40 yağlı UV objektif merceğe sahip konfokal mikroskopide uygulanır.
1. Çevre odasının sıcaklığını 28,5 °C'ye ayarlayın. Nemi sağlamak ve yumurta suyunun buharlaşmasını önlemek için odanın içine biraz ıslak mendil koyun.
2. Zebra balıklarıyla birlikte 35 mm cam taban kabını çevresel odaya yerleştirin.
3. Konfokal yazılımı açın ve sahneyi başlatın. 63.0 x 1.40 yağ UV objektîfine geçin ve parlak alan kanalı ile diferansiyel parazit kontrastı (DIC) filtresi kullanarak zebrafishi konumlandırın.
4. 405 Diod, Argon (%20 güç) ve DPSS 561 nm lazeri açın. Uygun lazer gücü ve spektrum ayarlarını kurun.
  NOT: Aşağıda, Cerulean (uyarılma = 405 nm; emisyon = ~456–499 nm), eGFP (uyarılma = 488 nm; emisyon = ~500–550 nm), DsRed2 (uyarılma = 561 nm; emisyon = ~575–645 nm) için spektrum ayarları verilmiştir.
5. "XYZ" "Ardışık Tarama" alma modunu seçin ve görüntü formatını "512 x 512 piksel" olarak ayarlayın.
6. "Canlı Veri Modu"na geçin. İlk zebrafish'in konumunu hedef alın ve "Start" ve "End" Z pozisyonlarını işaretleyin. Bu işlemi kalan embriyoların her biri için tekrarlayın. Programın sonunda bir "Duraklama" eklenebilir.
7. Programın döngüsünü ve döngüsünü tanımlayın.
8. Dosyayı kaydet.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1: Zebrafish embriyolarının canlı görüntüleme için montajı. (A) Orta beyin enfeksiyonu için, zebrafish embriyoları başları aşağıya doğru yerleştirilirdi. (B) Gövde bölgesi enfeksiyonu için, zebr...