Yenidoğan fare dalak fagositleriyle bakteriyel öldürmenin in vitro değerlendirmesi

Özet

Kaynak: Seman, B. G., et.al. Gram-negatif bakteriyel sepsisin yenidoğan görüntüleme modeli. J. Vis. Exp. (2020)

Bu video, nötrofillerin ve inflamatuar monositlerin neonatal fare dalaklarından izole edilmesini ve bunların parlak bakteri öldürücü testte uygulanmasını göstermektedir. Mekanik ayrışma, kırmızı kan hücresi lizisi, manyetik boncuk bazlı hücre zenginleştirmesi, bakteriyel kuluçka ve antibiyotik koruma konularını kapsar. Zamanlanmış lüminesans ölçümleri, başlangıçta bakteriyel içselleşmeyi ve ardından bağışıklık aracılı temizlenmeyi gösterir.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, ilgili hayvan etik inceleme komitesi tarafından incelenip onaylanmıştır.

1. In vitro bakteriyel öldürücü test

1. Enfekte olmamış bir yenidoğan yavrunun dalağını çıkarın ve steril 60 mm Petri kapının içine 40 μm naylon bir sepete yerleştirin. Bunu tekrarlayın ve dalakları tek bir tüpte biriktirerek birlikte toplanıp homojenleştirin.
2. %10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiş 5 mL fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) ekleyin.
3. Doku, steril 3 mL şırınga pistonu kullanılarak tek hücre süspansiyonu oluşturulana kadar parçalayın.
4. Tek hücreli süspansiyonu naylon sepetin dışından toplayın, 15 mL'lik santrifüj tüpüne aktarın ve pellet hücrelerini 350 x g hassasiyetinde 5 dakika boyunca koyun.
5. Hücreleri kırmızı kan hücresi lizisi tamponunda (7-8 dalağa kadar 2 mL) askıya alın ve eritrositleri elemek için oda sıcaklığında 5 dakika bekletin.
6. Splenositleri yukarıdaki gibi PBS ve peletlerle yıkayın.
7. Beklenen hücre verimine göre %0,5 BSA ve 2 mM EDTA takviyesi olan 0,25 mL PBS ile spelozitleri askıya alın.
8. Dalak sparklarını hemositometre veya uygun başka bir uygulama ile sayın.
9. Ly6B.2⁺ (granulosit/inflamatuar monositlerin miyeloid popülasyonu) hücrelerini immünomanyetik boncuklarla izole edin.
10. Tohum Ly6B.2⁺ hücreleri, siyah veya beyaz 96 kuyu ölçüsünde bir plakada, %10 FBS, 2 mM glutamin ve 25 mM HEPES (tam ortam) içeren siyah veya beyaz 96 kuyu plakasında.
11. Biyolüminesans E. coli'yi sayın ve bakteriyel aşıyı istenen enfeksiyon çokluğunda (MOI) 0,1 mL nihai hacimde hazırlayın. Bu, tüm kuyular için gerekli olanı ortak bir MOI ile toplu olarak yaparak en iyi şekilde yapılır.
12. Kontrol olarak 0.1 mL bakteriyel inokulum veya sadece tam ortam ekleyin. Çok kuyu plakasını 37 °C ve %5_CO2 sıcaklığında 1 saat kuluçka edin.
13. Medyayı gentamisin (100 μg/mL) içeren 0,2 mL taze tam ortamla değiştirin; bir pipetle nazikçe çıkarıp yeni bir pipet ucu ile taze ortam ekleyin. Kültürü 2 saat daha kuluçkaya geri döndür.
14. Enfeksiyondan 3 saat sonra, kapalı kültür plakasının her kuyusundaki lüminesansı tabandan bir plaka okuyucu ile ölçün ve ardından kültürü inkubasyona geri döndürün.
15. Diğer istenen zaman noktalarında lüminesans ölçümlerini tekrarlayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
ACK Liz Tamponu	Gibco	LSA1049201	Bakteriyel klirens testi
Anti-Ly-6B.2 Mikroboncuklar	Miltenyi Biotec	130-100-781	Hücre izolasyonu
Escherichia coli O1:K1:H7-lux (luciferazı ifade eder)	Yok	Yok	WVU'da kendi içinde inşa edilmiştir
İzolasyon Tamponu	Miltenyi Biotec	Yok	Bakteriyel klirens testi
LB Broth, Lennox	Fisher Biyoreaktifleri	BP1427-500	Bakteriyel büyüme
EASYtrainer (naylon sepet)	Greiner Bio-one	542 040	Hücre süzücüsü
SpectraMax iD3	Moleküler Cihazlar	Yok	Plaka okuyucu