Kapsüllenmiş Biyolüminesans Bakterilerle Yenidoğan Farelerde Enfeksiyonun Modellenmesi

Özet

Kaynak: Seman, B. G. ve diğerleri. Gram-negatif bakteriyel sepsisin neonatal görüntüleme modeli. J. Vis. Exp. (2020)

Video, kapsüllü biyolüminesans bakteriler kullanılarak sistemik enfeksiyonu incelemek için yeni doğumlu fare modelini gösteriyor. Yenidoğan yavrulara yüksek veya düşük dozlu bakteriyel askı enjeksiyonu yapılır ve doğum sonrası bakım için annelerine geri verilir. Kapsüllü bakteriler erken bağışıklık tespitinden kaçınır, sistematik olarak yayılır ve zamanla lüminesans görüntüleme ile görselleştirilir. Bu model, yenidoğan farelerde enfeksiyon ilerlemesinin invaziv olmayan şekilde izlenmesini sağlar.

Protokol

Hayvan modelleriyle ilgili tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından incelenmiştir.

1. Bakteriyel Aşı Hazırlanması

1. Escherichia coli O1:K1:H7-lux dondurucu stokundan tek bir koloninin izolasyonu için bir aşılama döngüsü olan triptik soya agar (TSA) plakasını çizerek çizin; bu stok lusiferaz ile stabil şekilde ifade edilir ve kanamisin direnci taşır. 37 °C'de gece kuluçka yapın.
2. Ertesi gün, Luria çorbasının (LB) oda sıcaklığına (25 °C) gelmesine izin verin.
3. Bir biyogüvenlik kabini kapağının altında, çizgili plakadan tek bir koloni tespit edin ve kanamisin (30 μg/mL) takviyesi ile 3 mL LB ile aşılayın. Gece boyunca 37 °C'de kuluçka yapın, dakikada 220 devir (rpm) ile sallanın. Bu başlangıç kültürüdür.
4. Başlangıç kültürünü 1:100 derecesinde biyolojik güvenlik kabini kaputu altında taze 3 mL LB içine seyreldin ve 2-3 saat boyunca 37 °C'de inkubatöre geri getirin (220 rpm). Bu stok kültür.
5. Hem boş hem de stok kültürün optik yoğunluğunu (OD) 600 nm'de spektrofotometre kullanarak okun. 96 kuyuyla düz tabanlı test plakasının bir kuyusuna 100 μL LB (bakteri içermeden) ekleyin; Burası boşluk. Sonra stok kültürden ayrı bir kuyuya 100 μL ekleyin. İki ek kopya için tekrarlayın. Soğurma ölçümü plaka okuyucu kullanılarak okunur.
6. Stok kültüründeki emilim değerinden (OD değeri) boş emilimi çıkarıp önceden oluşturulmuş ve doğrulanmış büyüme eğrisi ile karşılaştırın; böylece enfeksîyon dozunun hazırlanması için stok kültüründeki bakteri yoğunluğunun yaklaşık bir tahminini belirlenir.
7. Araştırma sorusuna göre hedef inokula oluşturun. Bu çalışmada fare (/fare) başına 2 x 10⁶ (düşük) ve 7 x 10⁶ (yüksek) koloni oluşum birimleri (CFU) hedef aşısı kullanıldı.
   1. Fare başına hedef dozu (DoseT) stok kültüründeki tahmini bakteri konsantrasyonuna (Stock) bölerek stok tüpten (VS) gereken bakteri hacmini elde edin.
   2. VS'yi, enfekte edilmesi gereken fare sayısı (NM) ile 5-10 ekstra madde ile çarpın; böylece enfeksiyon için gereken toplam bakteri miktarı ve 5-10 ek doz var. Bu hacmi stok tüpten çıkarıp yeni bir santrifüj tüpüne ekleyin.
   3. Aşağıdaki denklemi kullanın: DoseT/Stock = VS x NM = stok tüpten çıkarılacak bakterilerin toplam hacmi (VT).
8. Bakteriyi 2.000 x g ile 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj edin ve bakteri pelletini fare başına 50 μL fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) (pH 7.2-7.6) içinde yeniden askıya alın (örneğin, her dozda 10 doz 2 x 10⁶ bakteri için, 2 x 10⁷ bakteri peleti 500 μL PBS ile yeniden süspanse edilir). Yine, gereğinden fazla aşı hazırlanması tavsiye edilir. Kontrol aşıları için eşit miktarda PBS hazırlayın. Enfeksiyon aşısı ve PBS kontrolünü buzda enfeksiyona kadar koruyun.
9. 96 kuyu plastik tabanlı bir seyreltme plakasında PBS'ye yedi adet on kat seri seyreltme işlemi yapılacak ve 25 μL seyreltmeleri çift olarak kanamisin (30 μg/mL) ile desteklenen dörtre TSA plakalarına plaka ile örtün, böylece uygulanan bakteri miktarını saymak faydalı olacaktır. Koloni oluşumu için gece boyunca 37 °C'de kuluçka yapın, sayımdan önce.

2. Hayvan tanımlama

1. Yaşına uygun yavrular için yavrular senkronize edilebilecek yeterli sayıda üreme çifti düzenleyin. Yaş değişkenliği ± 1 gün kabul edilebilir.
2. Hamile bir C57BL/6 dişi faresini tespit edin ve planlanan deneyden önce yavrunun doğumunu takip ederek yaşını doğru şekilde belirleyin.
3. Kontrol ve enfekte 3 veya 4 günlük yavru yavruları ayırt etmek için, kontrol yavrularının kuyruk uçlarını kesmek için küçük, ince uçlu iris makası kullanın. Enfekte yavrular kuyruk kesimi almaz. Kuyruğu kesmeden önce, cildi %70 etanol ile ıslatılmış pamuk topuyla dezenfekte edin. Kuyruğun ucuna gerektiğinde pamuk topu veya gazlı bezle basın.
   NOT: Bu işlem biyogüvenlik kabin kaputu altında gerçekleştirilir. Yaklaşık 1/8 inç kuyruk kesimi yeterlidir.
4. Kontrol ve enfekte gruplar içindeki yavru köpekleri belirlemek için, yavru köpeklerin kuyruklarını dövme yapmak için 28 G x 1/2'' kalıcı iğneli 1 mL insülin şırıngası kullanın. Dövme yapmadan önce, cildi %70 etanol ile islatılmış bir pamuk topuyla dezenfekte edin. Bu işlem biyogüvenlik kabin kaputu altında gerçekleştirilir.
5. Kuyruğu dövme yapmak için iğnenin ucuna hayvan dövme mürekkebi uygulayın. Sonra, yavruyu bir elinizle dikkatlice tutun, kuyruğu tamamen açıkta olsun. İğneyi yüzeysel derinlik koruyarak nazikçe derinin altına sokun ve iğneyi deriyle birkaç milimetre paralel hareket ettirerek küçük bir işaret veya nokta oluşana kadar kullanın. İğneyi derinin altından yavaşça çıkarmadan önce birkaç saniye bekleyin, böylece fazla mürekkep derinin altından dışarı çıkmasını önleyin.
6. Yaraya gerektiğinde pamuk topu veya gazlı bezle baskı uygulayın. Cilt yüzeyindeki fazla dövme mürekkebi %70 etanol ile temizlen.
7. Bu süreç, enfekte ve kontrol gruplarındaki sonraki farelerle tekrarlanın, her ardışık yavru dövme yaptıkça ek bir nokta ekleyin (örneğin, yavru 1'in kuyruğunda 1 nokta, 2'nin kuyruğunda iki nokta vb.).
   NOT: Ek bir tanımlama katmanı için, kontrol ve enfekte gruplar için ayrı renkli hayvan dövme mürekkebi kullanılması önerilir.

3. Subskaküler aşı

NOT: Bu çalışma için, her deney için belirlenen düşük dozlu ve yüksek dozlu gruplarla 2 deney gerçekleştirildi. İlk deneyde, 7 yavru düşük dozlu aşı verildi (4 yavru kontrol olarak kullanıldı) ve ayrı bir yavru grubundan 5 yavru yüksek doz verildi (3 yavru kontrol olarak kullanıldı). Deney 1'deki yavrular sadece 24 saat için veri sağladı. İkinci deneyde, 8 yavruya düşük dozlu aşı verildi (2 yavru kontrol olarak kullanıldı) ve 6 yavruya yüksek dozlu aşı verildi (2 yavru kontrol olarak kullanıldı). Deney 2'den yavrular 0, 10 ve 24 saat zaman noktaları için veri sağladı.

1. Yaş eşleşmesi yavruları 1 gün ≤. Her yavruyu düşük dozlu veya yüksek dozlu yavru olarak atanıyın. Bir yavru grubunda, yavru yavru kurguları rastgele kontrol veya enfekte yavru olarak atayın.
2. Doğum sonrası 3 veya 4. günde, E. coli-lux veya PBS kontrolü ile aşılanmadan önceki tüm yavrular kilolarını kaydedin. Bu süre zarfında barajı yavrulardan ayırarak enfeksiyon sırasında hareket etmemelerini sağlayın.
3. İnsülin iğnesi kullanılarak bir biyogüvenlik kabinde ya PBS ya da E. coli-lux inokulumu aspire edilir. Bu çalışmada, fare başına 2 x 10⁶ ve 7 x 10⁶ CFU inokula kullanılmıştır. Hem enfeksiyon aşısı hem de PBS'yi buzda tutun, subskapulyar enjeksiyonla uygulanana kadar.
4. Yenidoğan, biyolojik güvenlik dolabının kapüşonuna temiz bir yüzeye yerleştirin ve yavruyu temizlemek için ense derisini kaldırın.
5. Şimdi hayvanın derisi ile kası arasında oluşan boşluğa iğneyi sokun, eğim ile derinin hemen altına yerleştirilin ve 50 μL PBS veya E. coli-lux enjekte edin. Enjeksiyonun geri akmasını önlemek için kısılmış deri kısmını aynı anda serbest bırakın.
6. İğneyi yavaş ve dikkatle çıkarın. Enjeksiyonlar bittikten sonra yavruları tekrar barajlarla yerleştirin. NOT: Gelişim aşamalarının anatomik aşaması nedeniyle, 3-4. günlerde neonatal yavrulara kuyruk damarı veya intraperitoneal enjeksiyon yapmak teknik olarak zordur. Bu nedenle, uygulamanın kolaylığı nedeniyle bu çalışma için subskaküler enfeksiyon yolu seçildi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1 mL İnsülin Şırıngası	Coviden	1188128012	Aşı veya PBS enjeksiyonu
Hayvan Dövme Mürekkep Yapıştırıcısı	Ketchum	KI1482039	Hayvan tanımlama
Hayvan dövmesi mürekkebi Yeşil Pasta	Ketchum	KI1471039	Hayvan tanımlama
Escherichia coli O1:K1:H7	ATCC	11775
Escherichia coli O1:K1:H7-lux (luciferazı ifade eder)	Yok	Yok	WVU'da kendi içinde inşa edilmiştir
DPBS, 1X	Corning	21-031-CV
Difco Triptik Soya Agar	Becton, Dickinson ve Şirketi	236950	Bakteriyel büyüme
IVIS Spectrum CT ve Canlı Görüntü 4.5 Yazılımı	Perkin Elmer	Yok	İntravital görüntüleme
LB Broth, Lennox	Fisher Biyoreaktifleri	BP1427-500	Bakteriyel büyüme