Fare diş dokusu kesitlerinde bakterilerin yerinde tespiti

Özet

Kaynak: Choi, Y. S. ve diğerleri. Parafinli dokularda bakterilerin yerinde tespiti, 16S rRNA'yı hedefleyen digoksin etiketli DNA probu kullanılarak. J. Vis. Exp. (2015).

Bu video, bakteriyel DNA'yı hedefleyen digoksin etiketli DNA probları kullanılarak fare diş eti dokusu kesitlerinde bakterilerin yerinde tespitini göstermektedir. Bölüm prob ile kuluçka edilir. Digoksine özgü alkali fosfataz ile konjuge edilmiş antikorlar eklenir. Endojen fosfatazlar inaktive edilir ve substrat eklenmesiyle renkli bir çökelti elde edilir. Bölüm karşı boyanmış, kurutulmuş, ksilen ile temizlenmiş ve bakterilerin mikroskobik görselleştirilmesinden önce monte edilmiştir.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, ilgili hayvan etik inceleme komitesi tarafından incelenip onaylanmıştır.

1. Prob Hazırlığı

1. Probun PCR amplifikasyonu
   1. Porphyromonas gingivalis-spesifik prob için, P. gingivalis 16S rRNA'nın 343-bp DNA parçasını P. gingivalis'in genomik DNA'sı ve aşağıdaki primerleri kullanarak PCR ile amplifikasyon edin: 5'- TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3' ve 5'- ACT CGT ATC GCC CGT TAT TC-3'. Aşağıdaki döngü koşullarıyla amplifikasyonlar yapın: 95 °C'de 30 saniye 35 çevrim, 30 saniye 60 °C ve 1 dakika 20 saniye 72 °C ile 72 dakika uzatma yapılın; ardından 72 °C'de 5 dakika uzatma yapılın.
   2. Oligonukleotid olarak sentezlenen 70-bp DNA parçası (5'-CAGGTGCTGCTGCTGCTCTCTCGTGTGTGAAATTGGTTGTGAAATTGGGTTAAGTCCCGCAACCCC-3') ve aşağıdaki primerlerle eubakteriyel probu amplifikasyon edin: 5'-CAG GTR CTG CMT GGY-3' ve 5'-AGG GTT GCG CTC GTT-3'. Aşağıdaki döngü koşullarıyla amplifikasyonlar yapın: 94°C'de 30 saniye 40 çevrim, 30 saniye 60 °C ve 1 dakika 20 saniye 72 °C ile 72 dakika uzatma yapılın; ardından 72 °C'de 5 dakika uzatma yapılın.
   3. PCR ürünlerini (≥500 μl) 3 M sodyum asetat (pH 5.2) ve %100 etanol (10:1:2 oranında) ekleyerek çökeltin ve -20 °C'de 2 saat kuluçka edin.
   4. Karışımı 14.000 x g ile 15 dakika boyunca santrifüjlen, peleti 100 μl Tris-etilenediaminetetraasetik asit (EDTA) veya TE tampon ile yeniden askıya alın ve DNA konsantrasyonunu 260 nm'de optik yoğunlukla ölçün.
2. DIGOKSIGENIN (DIG) etiketleme, DIG DNA etiketleme ve tespit kiti kullanılarak
   1. Probun 3 μg kısmını suyla karıştırın ve son hacmi 15 μl olur.
   2. DNA'yı 95 °C'de 10 dakika boyunca denatüre edin ve hızla buz üzerinde soğutun.
   3. Denatüre edilmiş DNA'nın 15 μl'sine 2 μl 10x heksanükleotid karışımı, 2 μl deoksinükleozid trifosfat (dNTP) etiketleme karışımı ve 1 μl Klenow enzimi ekleyin.
   4. 37 °C'de 24 saat ile 48 saat arasında karıştırın ve kuluçka yapın, ardından reaksiyonu 65 °C'de ısıtarak durdurun.
3. DIG etiketli probun hassasiyetini DIG DNA etiketleme ve tespit kiti kullanarak kontrol edin
   1. Kitte sağlanan pozitif kontrol probun 1 μl seri seyreltmesini ve DIG etiketli probun 1 ng naylon membrana üzerine manuel olarak yüklenin ve oda sıcaklığında (RT) 5 dakika kurutulun.
   2. Zarı kısa bir süre 2 adet tuzlu-sodyum sitrat (SSC) tamponunda (0,3 M sodyum klorür veya NaCl, 30 mM sodyum sitrat, pH 7,0) bekletin ve zarı 80 °C'de 1 saat boyunca inkübe ederek DNA'yı immobilize edin.
   3. Zarı kısa bir süre maleik asit tamponunda (MAB, 0,1 M maleik asit, 0,15 M NaCl, pH 7,5) bekletin ve RT'de kitte sağlanan 6 ml bloklayıcı çözelti içinde sulandırılmış anti-DIG alkali fosfataz (AP) ile incelendirilmiş antikor (1:5.000) ile RT'de 30 dakika boyunca inkübe yapın.
   4. Zarı MABT (MAB içinde %1 Tween 20) ile yıkayın ve 40 μl nitro-mavi tetrazolyum/5-bromo-4-kloro-3'-indolil fosfat (NBT/BCIP) çözeltisi, 2 ml tespit tamponu (0,1 M tris(hidroksimetil)aminometan hidroklorürid veya Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 0,05 M magnezyum klorür veya MgCl₂, pH 9,5) ile karıştırılmış 40 μl nitro-mavi tetrazolyum (NBT/BCIP) çözeltisi ile 1 dakika boyunca uygulanır. Etiketlenmiş probun hassasiyeti tatmin edici değilse, 1.1.3'ten 1.3.4'e kadar olan adımları tekrarlayın.
   5. Etiketli probun (OD₂₆₀) DNA konsantrasyonunu ölçün ve konsantrasyonu 100 ng μl-1'e ayarlayın.
4. DIG etiketli probun özgüllüğünü kontrol edin
   1. Belirli probun hedeflediği bakteri dahil olmak üzere çeşitli bakteri türlerinden genomik DNA örnekleri (örnek başına 25 ng 3 μl-1) 95 °C'de 10 dakika boyunca denatüre edilir ve buz üzerinde hızla soğutulur.
   2. Denatüre edilmiş DNA'yı elle naylon zara yükleyin ve RT'de 20 dakika kurutun.
   3. Zarı kısa bir süreliğine 2x SSC tamponunda bekletin ve DNA'yı immobilize etmek için zarı 80 °C'de 2 saat kuluçka altına alın.
   4. Zarı RT'de 1 saat boyunca bloklama çözeltisiyle bloklayın.
   5. Probu hibridizasyon tamponunda 1 ng μl-1 ile seyreltirin, seyreltilmiş probları denatüre edin ve bunları membrana uygulayın.
   6. Zarı 45 °C'de 1 saat boyunca kuluçka edin.
   7. Zarı 2x SSC tamponu ile üç kez yıkayın.
   8. Zarı kısa bir süreliğine MAB'a batırın.
   9. Anti-DIG AP ile konjuge edilmiş antikorlarla (1:2.000) 6 ml bloklayıcı çözelti ile RT'de 1 saat kuluçka yapın.
   10. Zarı MABT ile yıkayın ve 40 μl NBT/BCIP çözeltisi ile 2 ml tespit tamponu karıştırın.
   11. Prob beklenen özgüllüğü sağlamadığında, hibritleşme sıcaklığını artırın, ta ki bu özgüllük gözlemlenene kadar.

2. Yerinde Hibritleşme

Not: Numunelerin ve reaktiflerin kurumasını önlemek için, tüm kuluçkaları nemli bir odada ıslak kağıt havlularla kaplanmış şekilde gerçekleştirin.

1. De-parafinizasyon ve doku kesitlerinin rehidrasyonu
   1. Parafinli bloklardan 4 μm kalınlığında doku kesitleri hazırlayın. Formal, paraformaldehit ve çinko bazlı fiksator bu protokolle uyumludur.
   2. Tüm reaktifleri dietil pirokarbonat (DEPC) ile arıtılmış su ile hazırlayın.
   3. Kaydırmaları 60 °C'de kuru fırında 30 dakika ısıtın ve sürgüleri RT'de 30 dakika kuluçka yapın.
   4. Slaytları %100 ksilen içinde 5 dakika boyunca üç kez daldırın; Her seferinde taze ksilen kullanın.
      Not: Bu cildan temizleme işlemini kimyasal bir buhar davlumbazında yapın.
   5. Slaytları iki kez 5 dakika boyunca %100 etanole batırın, her seferinde taze etanol kullanın ve örnekleri seri 90%, %80 ve %70 etanol çözeltilerinde 5 dakika boyunca yeniden hidratlayın.
   6. Slaytları 1 dakika boyunca DEPC ile arıtılmış suya batırın ve slaytları 6 dakika boyunca DEPC ile işlenmiş fosfatla tamponlanmış tuzlu su veya PBS (pH 7.4) ile yıkayın.
2. Doku kesitlerinin ön tedavisi
   1. Slaytları 20 dakika boyunca 0,1 N hidroklorik asite batırın ve DEPC'le arıtılmış suda 30 saniye yıkayın.
   2. Örneklerin etrafına bir mum kalemi kullanarak hidrofobik bir bariyer çizin.
      Not: Hidrofobik bariyerin boyutu, örneklerin büyüklüğüne bağlıdır. Bu nedenle, aşağıdaki adımlarda kullanılan reaktif hacimleri numunelerin boyutuna göre değişir ancak hidrofobik bariyeri doldurmak zorundadır (küçük örnekler için 50 μl, büyük örnekler için 400 μl).
   3. Örnekleri 50 ila 400 μl proteinaz K (DEPC ile işlenmiş PBS'de 1 ila 10 μg ^ml-1 ) ile 37 °C'de kuru fırında 30 dakika boyunca tedavi edin ve DEPC ile işlenmiş 1x PBS ile 1 dakika boyunca slaytları yıkayın.
   4. DEPC ile işlenmiş PBS'de %4 paraformaldehit ile 10 dakika beklet, ardından DEPC ile işlenmiş PBS'de 1 dakika slaytları yıkayın.
   5. Slaytları %0,5 asetik anhidrit içeren 0,1 M trietanolamin-HCl (pH 8,0) içinde 20 dakika bekletin ve slaytları 30 saniye boyunca DEPC ile arıtılmış suda yıkama.
3. Prob ile hibritleşme ve yıkama
   1. Slaytları 2x SSC tamponuna 20 dakika daldırın.
   2. Probu hibridizasyon tamponunda 1 ng ^μl-1 ile seyreldin (4x SSC, %50 [vol/hacim] formamid, 1x Denhardt çözeltisi, %10 [wt/vol] dekstran sülfat, %0,1 [wt/vol] sodyum dodesil sülfat, 0,4 mg ml-1 somon sperm DNA'sı). Negatif kontroller için, etiketli probu 10 kat fazla etiketlenmemiş prob ile karıştırın.
   3. Sulandırılmış probları denatüre edin ve doku kesitlerine 50 ila 400 μl uygulanın. Sürgüye bir kapak kuşağı yerleştirin ve oje ile kapatın.
   4. PCR makinesinde 90 °C'de 10 dakika boyunca ısınabilir ve slaytları gece boyunca nemli bir odada (O/N) 45 °C'de veya 1.4.11. adımda belirlenen optimal sıcaklıkta inkubasyon yapar.
   5. Sürgüleri 4 °C'de 30 dakika soğutun, kapak kaymalarını çıkarın ve sürgüleri seri SSC tamponuna şu şekilde batırın: 4x SSC 10 dakika, önceden ısıtılmış (45 °C), 2x SSC 20 dakika, 2x SSC 10 dakika ve 0,2x SSC 10 dakika.
4. Anti-DIG AP-konjuge antikor ile tespit
   1. MABT'de slaytları 5 dakika yıkayın.
   2. 50 ila 400 μl bloklama çözeltisi ile %1 Tween 20 ile 20 dakika bloklayın.
   3. 50 ila 400 μl anti-DIG-AP antikoru bloklayıcı çözeltide (1:1.000) seyreltirilmiş ve 37 °C'de 90 dakika kuluçka yapın.
   4. Slaytları MABT'de 10 dakika yıkayın.
   5. Slaytları %1 Tween 20 içeren tespit tamponuna 5 dakika daldırın.
   6. 5 dakika boyunca 50 ila 400 μl 1 mM levamisol (%1 Tween 20 içeren tespit tamponunda) ile endogen alkali fosfatazı inaktive etmek için tedavi edin.
   7. Her bir numuneye önceden karıştırılmış NBT/BCIP çözeltisinden (1:100 hassasiyetinde algılama tamponunda seyreltilmiş) 50 ila 400 μl dağıtın ve slaytları RT'de nemlendirilmiş bir odada 2-3 saat kuluçka yapın, geliştirilmiş sinyal tatmin edici olana kadar.
   8. Görselleştirmeyi durdurmak için slaytları deiyonize suyla durulayın ve 37 °C'de karşı leke olarak 50 ila 400 μl 0,05% [wt/vol] metil yeşili 10 dakika uygulayın.
   9. Sürgüleri deiyonize suyla durulayın, %100 etanolde kurutun ve ksilenle daldırın.
   10. Her sürgüye 80 μl montaj çözeltisi uygulayın ve kapak kapaklarıyla örtün.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Asetik anhidrit	Sigma	6404
%50 Dekstran sülfat çözeltisi	Millipore	S4030
50X Denhardt'ın çözümü	Sigma	D2532
Dietil pirokarbonat (DEPC)	Sigma	P159220
Digoksigenin (DIG) DNA etiketleme ve tespit kiti	Roche	11 093 657 910
Formamid	Sigma	F9037
ImmEdge™ Pen	Dako	H-400
Levamisol	Vektör	SP-5000
Magnezyum klorür	Sigma	246964
Maleik asit	Sigma	M0375
Metil yeşili	Sigma	M6776
Paraformaldehit	Sigma	P1648
Permount	Fisher	SP15-500
Somon sperm DNA çözeltisi	Invitrogen	#15632-011
Sodyum klorür	Sigma	S9625
Sodyum sitrat	Duksan	D1420
Sodyum dodesil sülfat	Amresco	227
Trietanolamin-HCl	Sigma	90279
Tris-HÇL	Organik araştırma	3098T