$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modelleriyle ilgili tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından incelenmiştir.
Biyolüminesanslı Enfeksiyonun Görselleştirilmesi
- Enfeksiyonun ilerlemesini görselleştirmek için, test edilen Pseudomonas aeruginosa PGN5 ve VE2 suşlarına kromozomal biyolüminesans operon (luxCDABE) yerleştirin. Bu suşları etiketlemek için kullanılan plazmidler ve protokol Schweizer laboratuvarında geliştirilmiştir ve tüm bakteri türleri/suşlarıyla uyumlu olmayabilir. Önemli olarak, enfeksiyonun görselleştirilmesi isteğe bağlıdır; Bu nedenle, ölüm çalışması için bu operonun genomik olarak yerleştirilmesi gerekli değildir.
- Suşları hazırlayın ve doğrulayın. Ayrıca, her doğrulama aşamasında etiketlenmiş suşlarda biyolüminesans olup olmadığını kontrol edin.
- Suşlar hazırlandıktan sonra, hayvanları yukarıdaki adımları takip ederek 10'luk gruplar halinde biyolüminesans suşlarla enjekte edin.
- Hayvanları her 3 saatte bir, 24 saat boyunca biyolüminesans özelliğine sahip bir hayvan görüntüleme sistemi ile görüntüleyin.
- İlk olarak, kamera parametrelerini ayarlayarak ve hayvanlar için sahneyi ısıtarak görüntüleyiciyi hazırlayın. Sonra, oksijen akışını dakikada 1.5 L olarak ayarlayın (veya üreticinin önerilerine uyun).
- Görüntüleyici ve aşama stabilize edildikten sonra, enjeksiyondan hemen sonra bir fareyi anestezi odasına yerleştirin ve yaklaşık 4 dakika boyunca %3,5 izofluran O2 akışıyla odaya uygulanın. Anestezi yöntemleri, kullanılan oda ve/veya anestezi maddesine bağlı olarak değişebilir; Üreticinin önerilerini takip edin. Doğru anestezi çekilme refleks testi ile belirleyin.
- Fareyi sıcaklık stabilizatlı aşamaya taşıyın. Faresi kollarını açacak şekilde sırt üstü konumlandırın ve görüntüleme işlemi boyunca %2,5 izofluran uygulanacak burun koni takın.
- Kapıyı kapatın ve farenin biyolüminesans görüntüleri ve röntgenlerini çekin.
- Görüntüleme tamamlandığında, fareyi kafesine geri götürün ve izleyin. Fare 3-5 dakika içinde bilincini geri kazanmalıdır.
- Her 3 saatte bir fareleri 24 saat boyunca görüntülemeye devam edin, her seferinde her gruptan farklı bir fare kullanın. Anestezi tekrar maruz kalmanın olumsuz etkileri olabileceği için fareyi 24 saat içinde yeniden görüntülemeyin. Bir fare her 24-36 saatte bir sadece bir doz anestezi almalıdır. Her fare görüntülendikten sonra görüntüleme platformunu temizleyin. Görüntüleme zaman noktaları arasında görüntüleyiciyi kapatın.
NOT: Biyolüminesans, enjekte edilen suş ne olursa olsun solur. Biyolüminesansın yoğunluğu ve kömürlülüğü, enjekte edilen bakteri sayısı, fare suşu, bakteri suş gibi birçok faktöre bağlı olarak değişir.