Biyolüminesans kullanarak fare modelinde idrar yolu enfeksiyonunun görselleştirilmesi

Özet

Kaynak: Luyts, N. ve diğerleri. Biyolüminesans görüntüleme ile farelerde idrar yolu enfeksiyonlarının uzunlamasına takibi ve tedavisi. J. Vis. Exp. (2021).

Bu video, bakteriyel yapışma, invaziya ve hücre içi çoğaltmanın gerçekleştiği mesane içine enjekte edilen biyolüminesan E. coli kullanılarak fare modelinde idrar yolu enfeksiyonunun indüksiyonu ve izini göstermektedir. Biyolüminesans operondan yayılan ışık, enfeksiyon ilerlemesi sırasında bakteri yükünün gerçek zamanlı göstergesi olarak hizmet eder.

Protokol

Hayvan modelleriyle ilgili tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından incelenmiştir.

1. Hayvanların aşılanması

1. Hayvanların hazırlanması
   1. Araştırma sorusuna ve knock-out hatlarının bulunabilirliğine, deneysel detaylara ve İYE hassasiyetindeki farklılıklara bağlı olarak istenen fare suşunu seçin. Transüretral kateterizasyonun dişi farelerde daha kolay olduğunu unutmayın. 8 haftadan küçük hayvanları kullanmayın, çünkü bağışıklık sistemi olgunlaşmamıştır. Burada 12 haftalık dişi C57Bl/6J fareleri kullanıldı.
   2. Hayvanları önceden sipariş edin ve ideal olarak 7 gün boyunca uyum sağlamalarına izin verin. Hayvanları standart 12 saat ışık/karanlık koşullarda bireysel havalandırmalı kafeslerde grup olarak barındırın.
   3. Sinyal kaybını sınırlamak için hayvanların karın bölgesini tıraş edin. Tüy alma kremi kullanmayın, çünkü hayvanların derisini hızla yakabilir. Hayvanı baskın olmayan elinizle tıraş ederken boyun ve arka uzuvları sıkıca tutarak, baskın elinizle tıraş edin. Alternatif olarak, izofluran anestezisi altında tıraş olun.
      NOT: Hayvanlar, görüntülemeden 2 gün önce tıraş edildi, çünkü hayvanlar tıraş edilen bölgeyi daha da bakıma geçirecek.
   4. Deney boyunca su ve standart yiyecek sağlayışın. Ancak, mesane hacmini en aza indirmek için hayvanları instillasyondan önce 2 saat sudan mahrum bırakın.
   5. 100 μL'lik bir şırıngaya steril 24 G anjiyokateter ucu takın ve şırıngayı bakteriyel çözeltiyle doldurun.
      NOT: Arka plan lüminesansını belirlemek için, instillasyondan önce bir temel görüntü alın (aşağıdaki 2. adıma bakınız).
2. Hayvanların yerleştirilmesi
   1. Hayvanları bir indüksiyon odasına yerleştirin ve taşıyıcı gaz olarak saf oksijenle izofluran soluyarak anestezi yapın (indüksiyon %3, bakım %1,5).
   2. Bir hayvanı çalışma yüzeyine sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve dayılma sırasında burun konusuyla stabil izoflüran anestezisi sürdürün. Göz merhemini sür.
   3. Kalan idrarı hafif sıkıştırma uygulayarak ve suprapubik bölgede dairesel hareketler yaparak dışarı atın. Aşağı karın bölgesini instillasyondan önce %70 etanol ile temizleyin.
   4. Kateter ucunu normal salinle yağlayın. Baskın olmayan elin işaret parmağını karın bölgesine koyup nazikçe yukarı doğru it. Üretranın kateterizasyonuna 90° açıdan (dikey olarak) başlayın ve dirençle karşılaşıldığında, yatay olarak eğip daha fazla (0,5 cm) yerleştirin.
      NOT: Kateteri asla zorla itmeyin, çünkü bu üretraya zarar verir. Nazik çevirme hareketleri kateter takımında faydalı olabilir. Öte yandan, direnç eksikliği genellikle vajinaya yanlış yerleştirilmeyi gösterir.
   5. Bakteriyel inokulumun (2 x 10⁷ CFU) 50 μL yavaş (5 μL/s) instillasyonu yapılmalıdır.
      NOT: Daha yüksek hacimler veya daha hızlı instillasyon böbreklerde reflüye neden olabilir. Tekniğin uygulanması sırasında, mavi mürekkebi reflü değerlendirmek için kullanılabilir.
   6. Dayılmadan sonra, şırıngayı ve kateteri birkaç saniye daha yerinde tutun, sonra sızıntıyı önlemek için yavaşça geri çekin. Yüksek miktarda sızıntı veya kanlı bir etki gibi herhangi bir düzensizlik kaydedin ve gerekirse hayvanları hariç tutun.
   7. Hayvanı görüntüleme odasının burun konisinde sırtüstü pozisyona yerleştirin ve kalan tüm hayvanlar için önceki 1.1.1-1.1.6 adımlarını tekrarlayın. Her deneysel grup için bir kateter kullanın. Anestezinin devam ettiğinden emin olun ve ilk ile son hayvan arasındaki zamanı en aza indirin.
   8. Gerekirse, görüntülemeden önce veya sonrasında antibiyotik veya deneysel ilaçlar uygulayın (adım 2). Örneğin, enrofloksasin vermek için, 3,96 ml fizyolojik salin içine 40 μL enrofloxacin (100 mg/mL) çözeltisi ekleyerek 1/100 seyreltme elde edilir. Saat 9 ve 17:00'de deri altına 100 μL/10 g enjekte ederek günde iki kez 10 mg/kg enrofloksasin verin, 3 gün boyunca.

2. Biyolüminesans görüntüleme

1. Görüntüleme parametrelerinin hazırlanması ve seçimi
   1. BLI edinim yazılımını açın (bkz. Materyal Tablosu) ve görüntüleme cihazında Başlatma seçeneğine tıklayın (bkz. Materyal Tablosu) ve kamera ile sahne kontrolcü sistemini test etmek ve CCD kamerayı -90 °C'ye soğutmak için.
      NOT: Bu süreçte kapı kilitlenir ve başlatma süreci kontrol panelinde takip edilebilir. Yeşil ışık, -90 °C sıcaklığa ulaşıldığını gösterir. Başlatma tamamlanmadan görüntüleme denenirse uyarı görünür.
   2. Verilerin otomatik kaydedildiğinden emin olun: Otomatik kaydetme seçeneğine tıklayın ve doğru klasörü seçin.
   3. Lüminesansı seçin ve fotoğraf çekin. Varsayılan parıltı ayarlarını kontrol edin: Uyarılma filtresini Blok ve emisyon filtresini Açık olarak ayarlayın.
   4. İlk görüntü çekerken, özellikle loş sinyal beklerken, yeterli sayıda foton sayısını sağlamak için pozlama süresini Otomatik olarak ayarlayın. In vivo ölçümler ve parlak sinyaller için Pozlama Süresi'ni ~30 saniyeye ayarlayın. Eğer görüntü doygunsa, bir uyarı belirir. Eğer böyle olursa, pozlama süresini azaltın.
   5. Orta Binning'i seçin, F/stop 1 ve doğru görüş alanını (FOV) seçin (5 hayvan için D).
   6. Fareleri görüntüleme yaparken konu yüksekliğini 1 cm olarak ayarlayın.
   7. Erişim Kontrol Paneli'nde Ekle tuşuna üç kez tıklayarak teknik olarak üç görüntüden oluşan bir dizi elde edin.
2. Görüntüleme
   1. Fareleri görüntüleme odasına sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve deney boyunca anestezi (izofluran %1,5) korunmak için manifold burun koni kullanın. Aynı anda 5 fareye kadar görüntü alın ve yansımayı önlemek için ışık baffle ile hayvanları ayırın.
   2. Kapıyı kapatın ve görüntüleme dizisini başlatmak için Edin'e tıklayın.
   3. Deneyle ilgili ayrıntılı bilgileri doldurun (vahşi tip ve nakavt hayvanlar, tedaviler, görüntüleme günü vb.). Pozlama süresi gibi görüntü ayarları otomatik olarak kaydedilir.
   4. Fareleri görüntüleme odasından çıkarıp kafeslerine geri gönderin. Anestezi sonrası tam iyileşmeyi kontrol edin. Birkaç dakika içinde hayvanlar tamamen uyanık ve keşif etmeye başlamalıdır. Analjezi vermeyin çünkü bu idrar yolu enfeksiyonu sürecini engelleyebilir.
   5. Kafesleri bir sonraki görüntüleme döngüsüne kadar havalandırmalı raflara geri götürün. Deney tamamlandıktan sonra, hayvanları CO₂ boğulması veya servikal dislokasyon yoluyla ötenazi yapın. Bunu, izofloran anestezisinin iyileşmesinden önce yapın, böylece sıkıntıyı en aza indirmek

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Anestezi buharlaştırıcısı	Harvard Apparatus Limited	Yok	https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html
Baytril 100 mg/mL	Bayer	Yok	Enrofloksasin
BD Insyte Autoguard 24 GA	BD	382912	Sarı anjiyokateter, staklama için steril plastik uç kullanın
C57Bl/6J fareleri	Janvier	Yok
Santrifüj 5804R	Eppendorf	EP022628146
Dropsense 16	Unchained Labs	Trinean	OD 600nm ölçüm için
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salini, Gibco	ThermoFisher Scientific	REF 14040-083
Etanol %70 denatürasyon olmuş 5L	VWR uluslararası	85825360
Falcon 14ml Yuvarlak Tabanlı Polistiren Tüp, Çıtlık Kapak	Corning	352057
Falcon 50ml hücre başlangıcını	Greiner	227285
Hamilton GASTIGHT şırınga, PTFE luer kilidi, 100 μL	Sigma-Aldrich	26203	50 μL'nin yavaş bakteri aşılanmasını sağlamak için
Aşılama döngüsü	Roth	6174.1	tutucu: Sanat. No. 6189.1
Iso-Vet 1000mg/g	Dechra Veteriner ürünleri	Yok	İzofluran
IVIS Spektrumu In Vivo Görüntüleme Sistemi	PerkinElmer	REFERANS 124262	görüntüleme cihazı