Bitki Hücrelerine Gen Taşıması İçin Agrobakteriyel Kültürünün Hazırlanması

Özet

Kaynak: Shi, J. ve ark., Bitki patojenlerinin salgılanan efektörlerinden RNA susturucu baskılayıcılarının taraması ve tanımlanması. J. Vis. Exp. (2020)

Bu video, asetosyringon ile virülans gen ifadesi indükleyerek Agrobacterium tumefaciens kültürünün hazırlanması ve ardından antibiyotik çıkarılması ile yıkama ve yeniden süspansiyon ile yapılmasını ve bitki dokularına gen taşınması için dönüşüme hazır bir süspansiyon oluşturulmasını göstermektedir.

Protokol

1. Agrobakteriyel kültürün sızma için hazırlanması

1. Luria-Bertani (LB) plakasından pozitif bir koloni seçin ve hücreleri, 50 μg/mL kanamisin ve 50 μg/mL rifampisin takviyesi içeren 5 mL LB ortamı içeren cam bir tüpte aşılayın. Hücreleri 30 °C'de 200 rpm'de sallayarak 24−48 saat boyunca büyütün.
2. 100 μL kültür, aynı antibiyotikler, 10 mM 2-(N-morfolino) etansülfonik asit (MES; pH 5.6) ve 20 μM asetosiringon (AS) ile takviye edilmiş 5 mL LB ortamına aktarılır. Bakterileri 30 °C'de 200 rpm'de sallayarak 16−20 saat boyunca yetiştirin.
3. Santrifüj hücrelerini 4.000 x g ile 10 dakika boyunca koyun. Süpernatantı boşaltın ve pelleti 2 mL 10 mM MgCl₂ tamponla yeniden süzülün.
4. Antibiyotiklerin tamamen çıkarılmasını sağlamak için 1.3. adımı tekrarlayın.
5. Agrobakteriyel kültürünün yoğunluğunu 600 nm (OD₆₀₀) optik yoğunluğu ölçerek belirleyin. 10 mM MgCl₂ tampon ile OD_600'ü 1.5−2.0'a ayarlayın.
6. Son süspansiyon kültürlerine 10 mM MES (pH 5.6) ve 150 μM AS ekleyin ve hücreleri RT'de en az 3 saat boyunca sallanmadan kuluçka edin.
   NOT: Son askıya kültürlerini bir gecede bırakmayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
2-Morfolinoetansülfonik Asit (MES)	Biofroxx	1086GR500	Buffer
Asetosiringon (AS)	Sigma-Aldrich	D134406-5G	Agrobakteriyelin İndüksiyonu
Agar	Sigma-Aldrich	A1296-1KG	LB ortamı
Bacto Tripton	BD Biosciences	211705	LB ortamı
Bacto Maya Ekstraksiyonu	BD Biosciences	212750	LB ortamı
Kanamisin Sülfat	Sigma-Aldrich	K1914	Antibiyotikler
Rifampisin	MP Biyomedikal	219549005	Antibiyotikler
Sodyum Klorür	Amresco	0241-10KG	LB ortamı