Bakteriyel Enfeksiyonun Görselleştirilmesi İçin Fare Mesanesi Dokusu Hazırlanması

Özet

Kaynak: O'Brien, V. P. ve diğerleri, Tekrarlayan Escherichia coli Idrar Yolu Enfeksiyonu Gardnerella vaginalis mesane maruziyeti tarafından fare içinde tetikleniyor. J. Vis. Exp. (2020)

Bu video, önceden enfekte edilmiş bir fare modelinin mesane epitelinde bakteri kolonizasyonu ve konak-patojen etkileşimlerini görselleştirmek için taramalı elektron mikroskopisi kullanımını göstermektedir.

Protokol

Hayvan modelleriyle ilgili tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından incelenmiştir.

1. Taramalı elektron mikroskopisiyle mesane görüntüleme

   NOT: Bu işlem, üroteliumun görselleştirilmesi istenen herhangi bir zamanda gerçekleştirilebilir. Şekil 1'de (mor kutular) belirtildiği gibi, üropatojenik E. coli (UPEC) -ürotelyal etkileşimler, rezervuar oluşum aşamasında UPEC aşılamasından 6 saat ile 24 saat arasında en iyi şekilde görülür ve Gardnerella vaginalis tarafından tetiklenen ürotelyal eksfoliasyon en iyi şekilde ikinci G. vaginalis maruziyetinden sonra 3 saat ile 12 saat arasında görülür.

   1. Yerinde mesane fiksasyonu
      1. Mesade hasadı öncesi hemen önce glutaraldehit (%2,5 final) ve paraformaldehit (%2 final) ekleyin; 0,15 M sodyum kakodilat tamponuna 2 mM CaCl₂ ile pH 7,4'te ekleyin. Yeni açılmış cam ampüllerden paraformaldehit ve glutaraldehit kullanın, çünkü her iki fiksantif de zamanla açık kaplarda oksitlenir. DIKKAT: Glutaraldehit toksiktir, solunum tahrişiyetçisidir ve aşındırıcıdır; Paraformaldehit yanıcı, kanserojen, tahriş edici ve üreme toksinidir; Sodyum kakodilat toksik ve kanserojendir.
      2. 50 mL fiksatif çözelti yapmak için, pH 7.4'te 0.3 M sodyum kakodilat çözeltisi ile 4 mM CaCl 2 ile %16 paraformaldehit 6.25 mL %16 paraformaldehit, 2 mL %50 glutaraldehit ve 16.75 mL ultra saf su_eklen.
      3. Hazırlanan fiksantiyi mesanelere uygulamadan önce 37 °C'ye ısıtın.
      4. Tüberkülin slip-tip şırıngasını fiksator ile doldurun ve ucuna, karşıdaki şırınga işaretlerine eğim bakacak şekilde bir kateter takın. Fazla boruyu iğnenin ucundan 1-2 mm mesafeden kesin, iğne ucunu açığa çıkarmamaya dikkat edin. Şırıngayı hafifçe hareket ettirerek kabarcıkları çıkarın, pistonu havayı boşaltmaya itin ve kateteri mikrosantrifüj borusu üzerinden fiksatif ile doldurarak sabitleyiciyi doğru şekilde bertaraf etmek için toplayın.
      5. Fareyi onaylı bir yöntemle anestezi yapın ve feda edin (örneğin, anestezi altında servikal dislokasyon). Fareyi diseksiyon yüzeyine ayakları sabitlenmiş şekilde (lastik bantlar veya iğnelerle) yerleştirin. Farenin pelvik bölgesini pens ve cerrahi makasla açın, mesaneyi açığa çıkarın. Yanındaki yağı dikkatlice kenara itin ama mesaneyi yerinde bırakın.
      6. Şırıngayı baskın elinizle, iğne aşağıya bakacak şekilde ve iğnenin eğimi ile şırıngası işaretleri size karşı bakacak şekilde tutun. Kateter ucunu steril kayganlaştırmaya batırın.
      7. Kateter ucunu üretral açıklığa yerleştirin, şırınga namlusunu fare gövdesinin üzerinde 30-45° açı içinde uzak tutun.
      8. Ucunu çok küçük bir saat yönünde hareketle aşağı doğru basınç uygulayın ve kateteri nazikçe üretraya yerleştirin. Kateter ucu üretraya girerken, şırıngayı farenin kuyruğuna doğru menteşe ile geçirin ve kateteri üretraya daha da kaydırmaya devam edin, şırınga namlusu çalışma yüzeyine paralel hale getire. Tüm kateter iğnesinin şaftı (taban hariç) fareye girmeli ve kateter ucu mesane lümeninin içine yerleştirilmelidir.
      9. Yavaşça 50-80 μL fiksatif verin, mesane balon gibi şişirir. Kateteri yerinde tutun ve şırıngayı hafifçe kaldırın, ucunu yukarı kaldırın.
      10. Diğer elinizle, bir hemostatı açın ve üretra kesişimindeki kateter iğnesinin altına bir ucu kaydırın. Hemostat kısmen kapatıp iğneyle temas edene kadar kapatın.
      11. Kateter iğnesini mesaneden nazikçe dışarı kaydırarak hemostatı tamamen sıkıp kilitleyin, böylece fiksantın kaybı önlenir.
      12. Hemostatı çalışma yüzeyine paralel olacak şekilde tutun, mesane ise üstünde dursun. Hemostatın altını nazikçe kaldırın ve dikkatlice kesin (mesanenin karşı tarafında) hemostat hala bağlı halde mesaneyi çıkarın.
      13. Mesaneden ve bağlı hemostatı, ısıtılmış fiksant içeren bir Falcon tüpüne yerleştirin. Mesanenin sıvının tamamen içine girdiğinden ve tüpün duvarlarına bastırılmadığından emin olun. 4 °C'de 24 saat kuluçka yapın.
   2. Taramalı elektron mikroskopi (SEM) ile mesane işleme ve görüntüleme
      1. Temizlenmiş, iki taraflı bir jilet bıçağıyla mesaneyi sağgal olarak ikiye ayırın ve hemostata teğen ikinci bir kesik yaparak mesaneyi serbest bırakın. Bu sonuçta 2 yarım mesane "fincanı" oluşur. Mesanenin dışında kalan yağ pedleri varsa, onları nazikçe çıkarın.
      2. Mesane yarılarını üç kez (her biri 10 dakika) sodyum kakodilat tamponunda (0.15 M, pH 7.4) durulayın.
      3. Dokuyu %1 osmiyum tetrooksit ile 0,15 M kakodilat tamponunda oda sıcaklığında 1 saat boyanın. Osmiyum ışığa duyarlıdır; Bu nedenle, karanlık bir ortam sağlamak için boyama kabını folyoya sarılmış şekilde gerçekleştirin. ​
         DIKKAT: Osmiyum tetroksit toksiktir ve cilt için aşındırıcı bir yapıya sahiptir. Bu adımı eldivenle duman kapüşonunda yapın.
      4. Mesane yarısını üç kez (her biri 10 dakika) ultra saf suyla durulayın. Bu adımlar sırasında, bazen su yüzeyinde osmik yağ görülebilir. Kurutma aşamalarında kontaminasyonu önlemek için bunu aspirasyon veya fitile ile ile alın.
      5. Her biri 10 dakika boyunca derecelendirilmiş etanol serisine (50, 70, 90, 100 ve %100) batırarak dokuları kurutun.
      6. Sabit dokuyu kritik noktalı bir kurutucu ile kurutarak en yavaş hızda 12 CO₂ değişimi gerçekleştirin. Tüm ek ayarları yavaş olarak ayarlayın, havalandırma adımı hariç o da hızlı.
      7. Her mesaneyi temiz, çift taraflı bir jiletle ikiye bölerek toplam 4 parça oluşturularak numunenin eğriliğini azaltarak daha verimli kaplama, SEM'de görüntülemeyi kolaylaştırmak ve kurutma sırasında kıvrılmış olabilecek dokuları açığa çıkarmak için toplam 4 parça oluşturulur.
      8. Mesane parçalarını alüminyum bir sap üzerindeki iletken karbon yapıştırıcı sekmeye yapıştırın ve alt temas çevresine az miktarda gümüş yapıştırıcı boyayarak fazla yapıştırıcının mesanenin iç yüzeyine girmesini engellemeye özen gösterin.
      9. Numune stublarını 6 nm iridyumla kaplamak için yüksek vakumlu sputter kaplama kullanın. Numuneler şarj etmeye devam ederse, yüzeye iletken bir yolun gümüş boya ile boyandığından ve ek 4 nm iridyum ile kaplamadan emin olun.
      10. Örnekleri taramalı elektron mikroskobu ile görüntüleyin. Kullanılan mikroskopa göre koşullar değişebilir, ancak Everhart-Thornley (SE2) elektron dedektörü kullanıldığında, 3 KeV hızlandırıcı voltaj, 200 pA ışın akımı ve 12-13 mm çalışma mesafesi ile Zeiss Merlin FE-SEM üzerinde iyi çalıştı.

Sonuçlar

Şekil 1. Fare Modeli Şeması. Zaman çizelgesi, protokolde belirtilen modelin aşamalarını veya prosedürlerini yansıtacak şekilde vurgulanmıştır. Faz 1 (turuncu): Hücre içi üropatogenik E. coli (UPEC) rezervuarlarının oluşturulması. Far...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
30G x 1/2 iğne	BD	305106	Kateterler için
5 1/2" düz forsep hemostatı	McKesson	487377	Yerinde mesane fiksasyonu
ACE 600 Sputter kaplama	Leica		SEM örnek işleme
Alüminyum SEM kıvrımı	Ted Pella	16111	SEM örnek işleme
Kalsiyum klorür	EMS	12340	Yerinde mesane fiksasyonu
İletken karbon yapışkan tabı	Ted Pella	16084-1	SEM örnek işleme
İletken gümüş boya	Ted Pella	16034	SEM örnek işleme
CPD 300 Kritik Nokta Kurutucu	Leica		SEM örnek işleme
Sitohuni metal klipsi	Simport	M964B	Sitospin idrar tahlili
Etanol	EMS	15050	SEM örnek işleme
Glikoz	Sigma	G7528	NYCIII G. vaginalis büyüme ortamı için
Glutaraldehit	EMS	16320	Yerinde mesane fiksasyonu
Hema 3 boyama kiti	Fisher	23123869	Sitospin idrar tahlili
HEPES	Cellgro	25-060-Cl	NYCIII G. vaginalis büyüme ortamı için
İridyum	Ted Pella	91120	SEM örnek işleme
Merlin FE-SEM	Zeiss		Taramalı elektron mikroskobu
Milli-Q Su Temizleyici	Millipore	IQ-7000	SEM örnek işleme
Osmiyum tetrooksit	EMS	19170	SEM örnek işleme
Paraformaldehit	EMS	15710	Yerinde mesane fiksasyonu
Polietilen boru	Intramedic	427401	kateterler için
Proteoz Peptone #3	Fisher	DF-122-17-4	NYCIII G. vaginalis büyüme ortamı için
PTFE kaplı çift kenarlı jilet bıçağı	EMS	72000	SEM için kesim mesaneleri