Zebrafish embriyolarından bakterilerin izolasyonu ve yetiştirilişi enfeksiyon yükünü değerlendirmek için

Özet

Kaynak: Bernut, A. ve ark., Zebrafish embriyolarında Mycobacterium abscessus'un Patogenezi ve Kordonlanmasının Çözülmesi ve Görüntülemesi. J. Vis. Deneyim (2015).

Bu video, enfekte bir zebrafish embriyosundan Mycobacterium abscessus'u izole etmek ve nicelik ölçmek için bir protokolü göstermektedir. Bu işlem, embriyo ötenazisi, doku lizizasyonu ve homojenizasyonu ile bakterilerin serbest bırakılmasını, ardından santrifüj ve yüzeyaktif bir tamponda yeniden süspansiyonu içerir. Son olarak, bakteriyel süspansiyon seri olarak seyreltilir, antibiyotikle takviyeli agar üzerine örtülenir ve koloni oluşumu ve niceliklendirmesi için kuluçka altına alınır.

Protokol

1. M. abcessus Inoculumun Hazırlanması ve Depolanması
   1. M. abscessus büyüme koşulları
      1. M . abscessus , -80°C gliserol stokundan %10 OADC ve %0,5 gliserol (7H10OADc) içeren Middlebrook 7H10 agara tabaklanarak ve floresan proteini kodlayan vektörün taşıyan direnç belirtgesine bağlı olarak uygun antibiyotikle takviye edilsin. Plakaları 30 °C'de 4-5 gün kuluçka edin.
      2. Floresans pozitif bir mikobakteriyel koloni alın ve 1 ml Middlebrook 7H9 çorbasını, OADC, %0,2 gliserol, %0,05 Tween 80 (7H9OADc/T) takviyesi ile gerekli antibiyotikle 15 ml steril plastik tüpte aşılayın. 30 °C'de 1 hafta boyunca sallamadan kuluçka yapın.
         NOT: Tween 80, topaklanma ve bakteri toplamasını sınırlar.
      3. 2.1.2 ile elde edilen ön kültürü 50 ml Middlebrook 7H9OADc/T'de 150 cm2 doku kültürü şişelerinde son 0.1 OD_600'e (yaklaşık 5.107 bakteri/ml karşılık gelir) ile tekrar devam ettirin ve 30 °C'de 4 gün boyunca kuluçka ile ilerleyerek katlanarak büyüyen bir kültür elde edin (_{OD 600} = 0.6 ila 0.8).
         NOT: Özellikle kaba varyantın topaklanmasını en aza indirmek için kuluçka 5 günü geçmemelidir. Hem pürüzsüz hem de pürüzlü varyantlar benzer bir büyüme hızı gösterir.
2. M. abscessus inocula'nın hazırlanması
   NOT: Kaba M. abscessus'un büyük agregalar oluşturma ve kordon üretme eğilimi yüksek olduğundan, embriyolarda mikroenjeksiyondan önce homojen ve nicel olarak kontrol edilen inokula üretmek için özel bir tedavi gereklidir. Bu tedavi, agregalar üreten pürüzsüz bakterilere de uygulanır, ancak kaba suştan daha az derecede.
   1. 150 cm2 doku kültürü şişelerinden üstel olarak büyüyen kültürler, 4.000 x g hassasiyetinde 50 ml steril plastik tüpte 15 dakika boyunca RT'de santrifüjle alın ve bakteriyel pelleti 1 ml 7H9OADc/T ile yeniden süzülür. Aliquot 200 μl bakteriyel süspansiyonları 1,5 ml mikrosantrifüj tüplerine koyar.
      NOT: 1 ml şırıngalarda küçük hacimlerle çalışmak, yüksek homojen süspansiyonlar elde etmek için gereklidir.
   2. Bakteriyel süspansiyonları 26-G iğneyle (15 yukarı-aşağı dizeli) homojenleştirin, 10 saniye boyunca (her sonikasyon dizisi arasında 10 saniyelik mola olarak) su banyosu sonikatörü kullanarak üç kez sonikasyon yapın. 1 ml 7H9OADc/T ekleyin ve kısa bir süre girdabı oluşturun. Santrifüj 3 dakika boyunca 100 x g'de yapıldı.
   3. Mikobakteri içeren süspansiyonları dikkatlice toplayın, kümelerden kaçının ve homojen süspansiyonları 50 ml'lik steril bir plastik tüpte toplayın.
   4. Görsel olarak kalan bakteriyel agregaların varlığını kontrol edin.
      NOT: Agregatlar hâlâ varsa, 100 x g ile 2 dakika boyunca ek bir santrifüj aşamasına geçin ve üst gövdeyi toplayın.
   5. Süspansiyonu 4.000 x g ile 5 dakika santrifüjlendirin, peleti 200 μl 7H9OADc/T ile yeniden süspansiyona soluk yapın ve enjeksiyona geçin.
   6. Son bakteri konsantrasyonu, 7H10OADc agar üzerine seri suyulma (1x PBST) kaplama yaparak ve 4 gün boyunca 30 °C'de kuluçka sonrası koloni oluşturan birimleri (CFU) sayarak değerlendirin. Her yeni parti için CFU'lar belirlenmelidir.
   7. Donmuş inokula stoklarını 5 μl alikot ile -80 °C'de saklayın.
      NOT: -80°C donmuş alikotların CFU değerlendirmesi, canlı bakteri sayısının tam olarak belirlenmesi için ön koşuldur; çünkü donma/eritme aşının bakteriyel canlılığını etkileyebilir. Bu dondurulmuş inokulalar sonraki enjeksiyonlar için kullanıma hazırdır. Tüm aliquotlar aynı sayıda CFU içerdiğinden, bakterilerin bir deneyden diğerine tekrarlanabilir şekilde enjekte edilmesine olanak tanır.
3. Inoculum kalite kontrolü
   NOT: Ziehl-Neelsen boyama (mikobakterilere özgü) homojenizasyon prosedürlerinden önce ve sonra bakteriyel süspansiyonların kalitesini karşılaştırmak için kullanılabilir.
   1. Homojenleştirilmiş bakteriyel süspansiyondan bir damlayı cam sürgü üzerine yerleştirip yayın ve tamamen kurumasına izin verin. Leke'i en az 30 dakika boyunca 65-70 oC sıcak plakada sabitleyin ve Ziehl-Neelsen boyama protokolü ile boyayın.
   2. Bakteri smear'ı 100X objektif kullanarak mikroskopla gözlemleyin ve işlenmemiş bir bakteri süspansiyon ile karşılaştırın (Şekil 1).

2. Zebrafish Embriyolarının Hazırlanması

1. Zebrafish yumurtalarının yumurtlanması ve toplanması
   1. Yumurtlamadan bir gün önce, 2 erkek ve 1 dişi (genellikle optimal döllenme oranı için 2:1 oranı) bir üreme odasına yerleştirilerek yetişkin zebra balığı yetiştirin; bu odada ayrı bir akvaryum ve yumurta toplama sepeti bulunur.
      NOT: Yumurta toplama sepetleri, yumurtaların ebeveynler tarafından yenmesini önlemek ve yumurta hasadını kolaylaştırmak için kullanılır.
   2. 1 hpf'de, yumurtaları ve doğru şekilde gelişmiş embriyoları 25 ml mavi balık suyu (her tabak başına maksimum 100 embriyo) doldurulan 100 mm Petri kabında toplayın ve 28,5 °C'de tutulur. Döllenmemiş yumurtalar atılır.
2. Zebrafish embriyolarının enjeksiyon için hazırlanması
   1. Döllenme sonrası yaklaşık 24 saat (hpf) sırasında, embriyoları ince cımbızla 100 mm Petri kabında dekoryonla ayırın ve 28,5 °C'de tutun.
   2. 30-48 hpf embriyoları pipet kullanarak toplayın ve 270 mg/L tricaine içeren 25 ml balık suyuyla doldurulmuş "V" şeklinde bir konumlandırma odasına aktarın. Embriyoları, daha kolay mikro manipülasyon için optimize edilmiş ev yapımı mikroloader ucu aracı (ev yapımı kırpılmış mikroloader ucu) kullanarak kanallara doğru yerleştirin.
      NOT: Dorsal tarafı intravenöz enjeksiyonlar için kuyruk damarına aşağıya, kuyruk kası enjeksiyonları için dorsal tarafı yukarıya doğru yönlendirin.

3. Mikro enjeksiyon prosedürü

NOT:. M. abscessus enfeksiyonunun kronolojisini (hayatta kalma, bakteriyel yükler, kinetik ve enfeksiyon özellikleri) değerlendirmek için, 30 hpf embriyosunun kaudal damarına enjeksiyonlar tercih edilir. Bağışıklık hücrelerinin katılımını görselleştirmek için, enjeksiyonlar 48 hpf bir embriyonun kuyruk kasları gibi lokal bölgelerde yapılır.

1. Mikobakteriyel inokulumu 1X PBST ile (uygulanacak CFU sayısına bağlı olarak), %10 kırmızı fenol içeren ve doğru enjeksiyonu kontrol etmek için seyreltin.
2. Mikro kapiller enjeksiyon iğnesini mikro yükleyici ucu kullanarak 5-10 μl bakteri inokulum ile yükleyin, mikroenjeksiyon iğnesini enjektöre bağlı üç boyutlu mikromanipülatörün tutucusuna bağlayın ve iğnenin üst kısmını ince cımbızla kırarak 5-10 μm açılma çapı elde edin.
3. Enjeksiyon hacmini mikroenjeksiyon basıncını (20-50 hPa) ve zamanı (0,2 saniye) ayarlayarak kalibre edin.
   NOT: Gerekli enjeksiyon hacmi, embriyonun sarısına atılan damlanın çapının görsel olarak belirlenmesiyle kalibre edilir.
4. Kuyruk ven enjeksiyonu için, embriyoyu ventral tarafı iğneye bakacak şekilde konumlandırın ve iğne ucunu ürogenital açıklığa yakın bir yere yerleştirin, kaudal ven hedefi ve iğnenin ucunu nazikçe embriyoya iterek kuyruk ven bölgesini delmesini sağlar. İstenilen miktarda bakteriyel preparat verin; genellikle 1-3 nl civarında 100 CFU/nl içerir.
5. Kas içi enjeksiyon için, embriyoyu dorsal tarafı iğneye bakacak şekilde konumlandırın, iğneyi bir somitin üzerine yerleştirin ve küçük hacim (1 nl) inokulum enjekte edin.
   NOT: Kuyruk damarı enjeksiyonları için ise intramusküler enjeksiyonlar da zordur. Aşırı yüklenmeden kaçınmak gerekir, bu da çevredeki dokulara zarar verebilir.
6. Enjeksiyon işleminin sonunda, aynı hacimdeki bakteri süspansiyonunu steril PBST damlasına enjekte ederek inokulumun boyutunu kontrol edin, ardından 7H10OADc üzerine kaplama yapılarak CFU sayılır. Yaklaşık 100 embriyoya iğne enjekte edilebilir.
   NOT: Kaba M. abscessus iğnede agregatlar oluşturmaya devam edebileceğinden, inokulum hazırlandıktan hemen sonra enjeksiyonlar yapılmalıdır.
7. Enfekte balıkları tek tek 2 ml balık suyu içeren 24 kuyu plakalarına aktarın ve 28,5 °C'de kuluçka yapın. 1-3 nl 1X PBS enjekte edilen embriyolar kontrol olarak kullanılabilir.
8. Embriyolarda floresan bakterilerin doğru enfeksiyonu floresan mikroskop kullanılarak izlenir.

4. Bakteriyel Yük Miktarı

1. CFU sayımıyla belirlenme
   1. İstenen zaman noktasında, enfekte embriyoları (her koşul başına 5 tane) 1,5 ml mikrosantrifüj tüplerinde (1 embriyo/tüp) toplayın, embriyoları 10 dakika buzda kuluçka ile kriyo-anestezi yapın ve aşırı dozda trikain (300-500 mg/L) kullanarak ötenazi yapın
   2. Embriyoları steril suyla iki kez yıkayın ve yeni bir tüpte dağıtın. Her embriyoyu %2 Triton X-100 ile 1X PBST'de seyreltirilmiş 26-G iğne ile lizize edin ve süspansiyonu tam bir lizize kadar homojenize edin. Süspansiyonu santrifüj edin ve pelleti %0,05 Tween 80 ile 1X PBST'de yeniden askıya alın. Homojenatların seri seyreltmeleri Middlebrook 7H10OADc ile kaplamakta ve tedarikçinin önerisiyle BBL MGIT PANTA ile takviye edilir.
      NOT: M. abscessus , M . marinum'a göre NaOH tedavisine daha yatkındır.Balık lizatlarının M. abscessus büyümesini etkilemeden dekontaminasyonu, BBL MGIT PANTA antibiyotik kokteyli kullanılarak başarıyla gerçekleştirilebilir.
   3. Plakaları 30 °C'de 4 gün kuluçka yapın ve koloni sayın.

Sonuçlar

Şekil 1. Dağınık M. abscessus inocula'nın hazırlanması. Ziehl-Neelsen boyama, herhangi bir işlem öncesi (üst paneller) veya işlem sonrası (alt paneller) et suyu ortamında yetiştirilerek mikobakteriyel agregaların...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
BBL MGIT PANTA	BD Biosciences	245114
Sığır Serum Albümini	Euromedex	04-100-811-E
Sığır karaciğerinden katalaz	Sigma-Aldrich	C40
Difco Middlebrook 7H10 Agar	BD Biosciences	262710
Difco Middlebrook 7H9 Suyu	BD Biosciences	271310
Etil 3-aminobenzoat metansülfonat tuzu (Trikain)	Sigma-Aldrich	A5040
Oleik Asit	Sigma-Aldrich	O1008
Paraformaldehit	Delta Mikroskopi	15710
Fenol Kırmızı	Sigma-Aldrich	319244
Tween 80	Sigma-Aldrich	P4780
Agar	Gibco Life Teknolojisi	30391-023
Düşük eriyen agaroz	Sigma-Aldrich
Anında Okyanus Deniz Tuzları	Aquarium Systems Inc
Borosilikat cam kapillyarlar	Sutter instrument Inc	BF100-78-10	1 mm O.D. X 0.78 mm kimlik
Mikropipet çekici cihazı	Sutter Instrument Inc		Flamming/Brown Mikropipet Çekici p-87
Mikroenjektör	Tritech Araştırması		Dijital mikroINJECTOR, MINJ-D
Cizbit	Sciences Tools inc		Dumont # M5S
Mikro Yükleyici Uçları	Eppendorf