C. elegans'ta Aeromonas Patogenezi'nin Hayatta Kalma Testi Kullanılarak Modellenmesi

Özet

Kaynak: Chen, Y. ve diğerleri. Caenorhabditis elegans modelinde Aeromonas enfeksiyonunun virülansı ve patogenezi değerlendirilmesi. J. Vis. Exp. (2018)

Bu video, C. elegans kullanılarak Aeromonas patogenezini modellemek için bir hayatta kalma testini gösteriyor; burada bakterilerin ağızdan yutulması bağırsak enfeksiyonu ve ölüme yol açarak canlı bir konak sisteminde bakteriyel virülansın nicel olarak değerlendirilmesini sağlıyor.

Protokol

1. C. elegans Aeromonas ile Hayatta Kalma Testi

1. E . coli OP50 ile yayılan ENGM (zenginleştirilmiş nematod büyüme ortamı) üzerine L1 solucanlarının tohumlandığı gün, dört Aeromonas suşundan veya E. coli OP50'den her birinden tek bir koloni seçip sırasıyla 2 mL LB su suyu ile 37 °C'de 16 saat kültürlenin.
   NOT: Kontaminasyonu önlemek için bu adım laminar akış başlıkta yapılmalıdır. Burada aşağıdaki bakteriyel suşlar kullanılmıştır: E. coli OP50, C. elegans'ın normal besin kaynağı. A. dhakensis AAK1, ilk tam dizilenmiş patojenik klinik A. dhakensis izolatıdır. A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 ve A. caviae A2-9307121, Ulusal Cheng Kung Üniversitesi Hastanesi'nden temsil klinik izolasyonlardır.
2. Bakteriyel suyun OD₆₀₀ (600 nm'de optik yoğunluk) emilimini ölçün ve LB suyu ile bakteriyel suyu OD₆₀₀ = 2.0 olarak ayarlayın.
3. Her 6 cm NGM (nematod büyüme ortamı) plakasına 30 μL bakteriyel suyu yerleştirip yayın. Tabakları gece boyunca oda sıcaklığında kültürleyin.
   NOT: NGM hazırlamak için, 3 g NaCl (sodyum klorür), 2,5 g bakteriyel pepton ve 20 g agar 1 L deionize suda çözün. 121 °C'de 20 dakika otoklav. Su banyosunda 55 °C'ye kadar soğuyana kadar bekleyin, ardından 1 mL 1 M CaCl₂ (kalsiyum klorür), 1 mL 1 M MgSO₄ (magnezyum sülfat), 1 mL %5 kolesterol etanol ve 25 mL fosfat tamponu ekleyin. İyi karıştırmak için döndür.
4. L1 solucanlarının L4 aşamasına ulaştığı gün, dört Aeromonas suşunun veya E. coli OP50'nin her birini içeren 50 solucanı rastgele bir NGM plakasına seçip aktarın.
5. NGM plakalarını test bitene kadar 20 °C'de kuluçka yapın.
6. Tüm canlı solucanları yeni hazırlanmış bakteri içeren bir NGM plakasına aktarın ve son solucan ölene kadar her gün canlı, ölü ve sensör solucanlarının sayısını sayın.
   NOT: Enfeksiyonun korunması için her gün solucanları taze hazırlanmış bir NGM plakasına aktarın, steril solucanlar (örneğin, glp-4 veya FudR ile) kullansanız bile.
7. Günlük veri hesaplamasına dayanarak hayatta kalma eğrilerini çizin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Shaker kuluçka makinesi	YIH DER	LM-570R	Bakteri kuluçka
NaCl	SIGMA	31434	Kültür ortamı hazırlanması
MgSO₄	SIGMA	M7506	Kültür ortamı hazırlanması
Agar	Difco	214530	Kültür ortamı hazırlanması
CaCl₂	SIGMA	C1016	Kültür ortamı hazırlanması
Kolesterol	SIGMA	C8503	Kültür ortamı hazırlanması
6 cm Petri levha	ALPHA PLUS	46	Agar tabak hazırlama
Bakteriyel pepton	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	Kültür ortamı hazırlanması
FudR	SIGMA	1271008	Kültür ortamı hazırlanması
Mikroskop sistemi	Nikon	Eclipase Ti ters çevrilmiş	Mikroskop görüntüleme