C. elegans Sıvı Toksisite Testi ile Bakteriyel Virulansın Değerlendirilmesi

Abstract

Kaynak: Chen, Y. ve diğerleri. Caenorhabditis elegans modelinde Aeromonas enfeksiyonunun virülansı ve patogenezi değerlendirilmesi. J. Vis. Exp. (2018).

Bu video, besin sınırlı sıvı ortamda solucanların hayatta kalmasını ölçerek bakteriyel virülansı değerlendirmek için kullanılan C . elegans Aeromonas ile Sıvı Toksisite Testini gösteriyor. Test, C. elegans'ta toksin kaynaklı hasar ve ölüm oranına dayalı suş özgül patojenikliği ortaya koymaktadır.

Protocol

1. C. elegans Aeromonas ile Sıvı Toksisite Testi

NOT: Kontaminasyonu önlemek için adımlar laminar akış başlıkta yapılmalıdır.

1. L1 solucanlarını ENGM (Zenginleştirilmiş nematod büyüme ortamı) plakasına ekmekten sonraki gün E. coli OP50 ile yayın, dört Aeromonas suşundan ve E. coli OP50'den her birinden tek bir koloni seçin ve her biri 5 mL LB et suyu ile 37 °C'de 16 saat kültürlendirin.
   NOT: Protokolde aşağıdaki bakteri suşları kullanıldı: E. coli OP50, C. elegans'ın normal besin kaynağı. A. dhakensis AAK1, ilk tam dizilenmiş patojenik klinik A. dhakensis izolatıdır. A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 ve A. caviae A2-9307121, Ulusal Cheng Kung Üniversitesi Hastanesi'nden temsil olarak klinik izolasyonlardır.  
   NOT: Zenginleştirilmiş NGM (ENGM) hazırlamak için, 3 g NaCl, 5 g bakteriyel pepton, 1 g maya ekstraktı ve 30 g agar 1 L deionize suda çözünür. 121 °C'de 20 dakika otoklav. Su banyosunda 55 °C'ye kadar soğuyana kadar bekleyin ve 1 mL 1 M CaCl₂, 1 mL 1 M MgSO₄, 1 mL %5 kolesterol etanol ve 25 mL fosfat tamponu ekleyin. İyi karıştırmak için döndür.
2. Bakteri çorbasının OD₆₀₀ emilimini ölç.
3. Bakteriyel suyu 3.500 x g sıcaklığında 15 dakika boyunca santrifüjlenerek LB çorbasını çıkarın. Bakteriyi tekrar askıya alın ve bakteriyel suyu S ortamında OD₆₀₀ = 3.0 olarak ayarlayın. S ortamında 195 μL bakteriyel suyu 96 kuyuyla en az 8 kuyuya ekleyin.
   NOT: S ortamının bileşimi: S ortamı hazırlamak için, kullanımdan önce 40 mL S bazal, 0,4 mL 1 M potasyum sitrat, 0,4 mL iz metal çözeltisi, 0,12 mL 1 M CaCl₂, 0,12 mL 1 M MgSO₄, 40 μL %5 kolesterol etanol ve 1 mL 8 mM FudR karıştırın.
4. ENGM plakasındaki L4 solucanlarını M9 ortamı kullanarak E. coli OP5 ile yıkayın. Solucan çözeltisini μL'de 5 solucan konsantrasyonuna ayarlayın ve 96 kuyu plakasının her kuyusuna 5 μL solucan çözeltisi ekleyin. Her kuyu başına yaklaşık 25 solucan olduğundan emin olun.
5. 96 kuyu plakasını 200 rpm'de 25 °C'de bir shaker üzerinde kuluçka yapın.
6. 24, 48 ve 72 saat sonra canlı ve ölü solucan sayısını say. Her kuyunun hayatta kalma oranlarını şu formülle hesaplayın: (Canlı solucanlar/Toplam solucanlar) × %100.
7. Günlük veri hesaplamasıyla bir dağılma grafik grafiği çizin.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Shaker kuluçka makinesi	YIH DER	LM-570R	Bakteri kuluçka
NaCl	SIGMA	31434	Kültür ortamı hazırlanması
MgSO₄	SIGMA	M7506	Kültür ortamı hazırlanması
Agar	Difco	214530	Kültür ortamı hazırlanması
CaCl₂	SIGMA	C1016	Kültür ortamı hazırlanması
Kolesterol	SIGMA	C8503	Kültür ortamı hazırlanması
Etanol	SIGMA	32205	Kültür ortamı hazırlanması
KOH	SIGMA	P5958	Kültür ortamı hazırlanması
6 cm Petri levha	ALPHA PLUS	46	Agar tabak hazırlama
96 kuyu plakası	FALCON	353072	Sıvı testi
Bakteriyel pepton	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	Kültür ortamı hazırlanması
Maya ekstraktı	SIGMA	92144	Kültür ortamı hazırlanması
Sitrik asit•H₂O	SIGMA	1909 civarı	Kültür ortamı hazırlanması
Tri-potasyum sitrat•H₂O	SIGMA	104956	Kültür ortamı hazırlanması
FudR	SIGMA	1271008	Kültür ortamı hazırlanması
Disodyum EDTA	SIGMA	E1644	Kültür ortamı hazırlanması
Tripton	SIGMA	16922	Kültür ortamı hazırlanması
Mikroskop sistemi	Nikon	Eclipase Ti ters çevrilmiş	Mikroskop görüntüleme
Bilimsel CCD Kamera	QImaging	Retiga-2000R Hızlı 1394	Mikroskop görüntüleme