Patojenik Aeromonas Suşuyla İndüklenen C. elegans'ta Kas Nekrozu Testi

Özet

Kaynak: Chen, Y. ve ark., Caenorhabditis elegans modelinde Aeromonas Enfeksiyonunun Virulansı ve Patogenezi Değerlendirilmesi. J. Vis. Exp. (2018)

Bu video, patojenik Aeromonas suşları kullanılarak C. elegans (Caenorhabditis elegans) üzerinde kas nekrozu testini göstermektedir. Aeromonas tohumlu plakalarda yeşil floresan protein (GFP) ekspresyonu olan solucanları besleyerek analiz, bakteriyel enfeksiyonu modeller ve floresan görüntüleme yoluyla doku hasarını ortaya çıkarır. Kas yapısının ve GFP sinyalinin ilerleyici kaybı, Aeromonas kaynaklı nekrotik bir yanıtı gösterir.

Protokol

1. Caenorhabditis elegans Aeromonas ile Kas Nekrozu Testi

NOT: Kontaminasyonu önlemek için bu adımlar laminar akış başlıkta yapılmalıdır.

1. L1 solucanların, Escherichia coli OP50 ile yayılmış zenginleştirilmiş nematod büyüme ortamına (ENGM) tohumlandığı gün, dört Aeromonas suşundan ve E. coli OP50'den her birinden tek bir koloni seçilip 37 °C'de 16 saat boyunca 2 mL Luria-Bertani (LB) suyu ile kültürlendirin. NOT: Burada aşağıdaki bakteri suşları kullanılmıştır: E. coli OP50, C. elegans'ın normal besin kaynağı. A. dhakensis AAK1, ilk tam dizilenmiş patojenik klinik A. dhakensis izolatıdır. A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 ve A. caviae A2-9307121, Ulusal Cheng Kung Üniversitesi Hastanesi'nden temsil klinik izolasyonlardır.
2. Bakteri çorbasının OD₆₀₀ emilimini ölçün ve bakteri suyu LB çorbasıyla OD₆₀₀ = 2.0 olarak ayarlanın. 30 μL bakteriyel suyu 6 cm nematod büyüme ortamı (NGM) plakalarına yerleştirin ve yayın. Tabakları gece boyunca oda sıcaklığında kültürleyin.
3. L1 solucanlarının L4 aşamasına ulaştığı gün, dört Aeromonas suşundan veya E. coli OP50'den her birine sahip her NGM plakasına 50 solucan aktarılır. NGM plakalarını 20 °C'de kuluçka yapın. Solucanları her 24 saatte bir bakteri içeren yeni hazırlanmış NGM plakalarına aktarın.
4. Floresan mikroskopu kullanarak kas görüntüleri alın.
   1. M9 ortamında 2% agaroz jeline rastgele 10 solucan seçin. Solucanları M9 ortamında agaroz üzerinde 2 μL %1 sodyum azid kullanarak 5 dakikadan kısa süre felç etmekten önce görüntü alın.
   2. Bir kapak kuşağı yerleştirin ve kas görüntülerini yeşil floresan protein (GFP) filtresiyle şarjlı bağlı cihaz kamerası ile floresan mikroskop üzerinde çekin. Kas görüntülerini L4 evresinden 24, 48 ve 72 saat sonra yakalayın.

Görüntü analiz ve figür hazırlama ile görüntü işleme yazılımı ile çalışmak.
NOT: Puanların ve kas hasar seviyelerinin tanımları Şekil 1'de gösterilmiştir ve kriterler şu şekilde listelenmiştir: eksik kas lifleri için 3 puan; Yırtılmış veya kırılmış kas lifleri için 2 puan; 1 puan bükülmüş kas lifleri için; Sağlıklı kas lifleri için 0 puan.

Sonuçlar

Şekil 1: Aeromonas enfeksiyonu tarafından indüklenen C. elegans'taki kas nekrozu için ilgili puanlar . Kas nekrozu için kriterler ve buna karşılık gelen puanlar şunlardır...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Shaker kuluçka makinesi	YIH DER	LM-570R	Bakteri kuluçka
K₂HPO₄	J.T.Baker	MP021519455	Kültür ortamı hazırlanması
KH₂PO₄	J.T.Baker	3246-05	Kültür ortamı hazırlanması
Na₂HPO₄	J.T.Baker	MP021914405	Kültür ortamı hazırlanması
NaCl	SIGMA	31434	Kültür ortamı hazırlanması
MgSO₄	SIGMA	M7506	Kültür ortamı hazırlanması
Agar	Difco	214530	Kültür ortamı hazırlanması
CaCl₂	SIGMA	C1016	Kültür ortamı hazırlanması
Kolesterol	SIGMA	C8503	Kültür ortamı hazırlanması
Etanol	SIGMA	32205	Kültür ortamı hazırlanması
KOH	SIGMA	P5958	Kültür ortamı hazırlanması
6 cm Petri levha	ALPHA PLUS	46	Agar tabak hazırlama
Bakteriyel pepton	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	Kültür ortamı hazırlanması
Maya ekstraktı	SIGMA	92144	Kültür ortamı hazırlanması
Sitrik asit•H₂O	SIGMA	1909 civarı	Kültür ortamı hazırlanması
Tri-potasyum sitrat•H₂O	SIGMA	104956	Kültür ortamı hazırlanması
FudR	SIGMA	1271008	Kültür ortamı hazırlanması
Disodyum EDTA	SIGMA	E1644	Kültür ortamı hazırlanması
FeSO₄·7H₂O	SIGMA	215422	Kültür ortamı hazırlanması
MnCl₂·4H₂O	SIGMA	221279	Kültür ortamı hazırlanması
ZnSO₄·7H₂O	SIGMA	204986	Kültür ortamı hazırlanması
CuSO₄·5H₂O	SIGMA	C8027	Kültür ortamı hazırlanması
Tripton	SIGMA	16922	Kültür ortamı hazırlanması
Mikroskop sistemi	Nikon	Eclipase Ti ters çevrilmiş	Mikroskop görüntüleme
Bilimsel CCD Kamera	QImaging	Retiga-2000R Hızlı 1394	Mikroskop görüntüleme