Curli Lif Aracılı Bakteriyel Hidrojel Desenlerinin Stabilizasyonu

Özet

Kaynak: Spiesz, E. M. ve diğerleri, Kendi Yap Biyoyazıcı ile Mühendislik Biyofilmlerinin Üç Boyutlu Desenlenmesi. J. Vis. Exp. (2019)

Bu video, kontrol veya genetik olarak modifize edilmiş bakteri suşları içeren 3D baskılı alginat desenlerini karşılaştırma yöntemini göstermektedir. Test suşu, indüksiyonda kıvrımlı lifler üretir ve bu da alginat hidrojel yapısını pekiştirir. Kalsiyum-şelatasyon çözeltisi ile işlemden sonra sadece test deseni korunur ve bu da kıvırcık lif üretiminin stabilizasyon etkisini vurgular.

Protokol

1. 3D baskı süreci

1. Bilgisayara 3D baskı yazılımını (Materyal Tablosu) kurup açın. 3D yazıcıyı bilgisayara bağlayın. X, Y ve Z eksenleri için ana butona tıklayarak yazıcı kafayı ana konumuna taşıyabilirsiniz.
2. Her baskı için, hazırlanmış bir baskı tabanını baskı tablasında belirli bir yere yerleştirin.
3. Print başlığının yüksekliğini Z ekseninde kalibre edin.
   1. Baskı başlığını manuel kontrolde 22 mm yüksekliğe yükseltin ki istenen pozisyona hareket ederken petri kabının kenarına çarpmasın. Baskı başlığını plakanın üzerine yerleştirin ve pipet ucu baskı yüzeyine temas edene kadar aşağı doğru hareket ettirin. Bu Z eksenini Z1 (baskı yüzeyinin yüksekliği) olarak atayın.
   2. Baskı başlığını kaldırın ve X, Y ve Z eksenlerinde manuel kontrolle plaka alanının dışına çıkarın. Eğer yazıcı başlığı ile plaka yüzeyi arasındaki çalışma mesafesi Z2 olarak tanımlanıyorsa, baskı sırasında Z1 + Z2 olarak baskı programına Z-değeri olarak girin.
4. İstenen yörüngeye göre kendi geliştirdiği, nokta puan koordinat belirlenen bir yöntemle baskı şeklini programlayın.
   1. İstenen yörünge düz bir çizgiyse, sadece başlangıç ve bitiş noktalarını tanımlayın. Eğri çizgilere ek noktalar eklendiğinde, daha düzgün eğriler elde edilir. Yazıcı başlığını her noktaya manuel olarak ardışık olarak hareket ettirin ve bu noktaların koordinatlarını sırayla kaydedin. Tüm bu koordinatları ve her basılı segment için yazıcı başlığı hareket hızını G-kod düzenleyicisine girin.
5. Hem baskıdan önce hem de sonra, baskı başlığını plaka kenarından (20 mm) daha yüksek bir mesafeye kaldırın ve doğrudan plaka bölgesinden dışarı hareket edin. Bu programı G-kod dosyası olarak kaydedin ve sonraki baskılarda kullanmak üzere doğrudan yükleyin, her yeni baskı altı için Z ekseni yüksekliğini yeniden ölçün.
   NOT: Bir kare basmak için örnek bir G-kodu için Tablo 1'e bakınız.
6. Önceden programlanmış G-kod dosyasını yükleyin. Yazılımda G-kod düzenleyicisini açın ve istenen şekli yazdırmak için komutları programlayın. Her komut satırında, yazıcı başlığının konumu X, Y ve/veya Z ekseninde değiştirilebilir. Tüm baskı adımlarında Z değerini Z1 + Z2 (baskı yüzeyinin yüksekliği + çalışma mesafesi) olarak girin.
   NOT: Hareket hızı da ayarlanabilir; 9.000 mm/dakika tipik baskı hızları için uygun bir değerdir.
7. Sıvı biyo-mürekkepi şırınga(lara) yükleyin ve 3D biyoyazıcının şırınga pompasına monte edin.
8. Biyo-mürekkebi baskı alt tabakasına Print butonuna tıklayarak yazdırın.
9. Baskı sırasında, yazıcı başlığı hareketini tamamen yazılım tarafından kontrol edin. Yazıcı başlığı baskı yüzeyine temas etmeden önce şırınga pompasını manuel olarak çalıştırın.
   NOT: Şırınga pompası ile yazıcının koordinasyonu, ekstrüzyon hızı, yazıcı başlığın ilk baskı noktasına hareket hızı ve yazıcı başlığının başlangıç konumuna bağlı olarak ampirik olarak belirlenir. Eğer ilk baskı başlığı pozisyonu 20 mm ise, baskı başlığı hızı 9.000 mm/dakika ve ekstrüzyon hızı 0,1 mL/s, baskı başladıktan hemen sonra şırınga pompasını çalıştırın. Ekstrüzyon hızı 0.1 mL/s'den 0.3 mL/s'ye değiştirilirse, baskı başladıktan sonra şırınga pompasını çalıştırmak için 2−3 saniye bekleyin.
10. Baskı başlığı baskının son noktasına gelir gelmez şırınga pompasını durdurun. Baskı sürecinin sonunda yazıcı kafası kalkmadan önce şırınga pompasını durdurun, aksi takdirde fazla biyo-mürekkeb baskı yüzeyine düşer ve baskı çözünürlüğü düşürülür.
11. 3D yapıların inşasında, yazıcı başlığının tüm hareketlerini G-kod düzenleyicide kontrol edin. İlk katmanın baskı yüksekliğini yazın. İkinci katman için G-kodundaki Z-değerini 0,2 milimetre artırarak baskı yüksekliğini artırın. Daha sonra, daha yüksek bir katmana geçerken Z-değerini 0,1 milimetre artırın. Baskı sırasında plakayı hareket ettirme.
12. Basılı hidrojelin genişliğini ve yüksekliğini ölçmek için, numunenin altına veya yanına yerleştirilmiş çelik bir cetvel kullanın.

2. E. coli tarafından biyofilm üretiminin yetiştirilmesi ve etkinliğinin test edilmesi

1. Basılı örnekleri oda sıcaklığında 3−6 gün kuluçka altına alın, böylece biyofilm bileşenleri (curli lifleri) üretilebilsin. Plakaları bir kamera veya floresan tarayıcı ile görüntüleyin.
2. Alginat matrisini çözmek için, baskı tabanlarına 20 mL 0,5 M sodyum sitrat çözeltisi (pH = 7 NaOH ile ayarlanmış) ekleyin ve oda sıcaklığında 30 rpm'de çalkalayarak 2 saat kuluçka yapın. Sıvıyı atıp plakaları tekrar görüntüleyin, sitrat işleminden önceki plakaların görüntüleriyle karşılaştırın.

Tablo 1: Kare basmak için programlama süreci ve G-kodunun açıklamaları.

G-kod komutları	Görevler
G1 Z20 F9000	Z eksenini 20 mm yüksekliğe 9.000 mm/dakika hareket hızıyla kaldırın.
G1 X95 Y65 F9000	İlk satırın başlangıç noktasına 9.000 mm/dakika hareket hızıyla ilerleyin.
G1 Z6 F9000	Z yönünde aşağıya doğru (burada Z = 6 mm) bir baskı mesafesine ulaşın.
G1 X95 Y105 F300	İlk satırın bitiş noktası ve ikinci satırın başlangıç noktası.
G1 X135 Y105	İkinci satırın bitiş noktası ve üçüncü satırın başlangıç noktası.
G1 X135 Y65	Üçüncü satırın bitiş noktası ve dördüncü satırın başlangıç noktası.
G1 X95 Y65	Dördüncü satırın bitiş noktası ve ilk satırın başlangıç noktası; bir kare oluşur.
G1 Z20 F9000	Z eksenini 9.000 mm/dakika hızla 20 mm yüksekliğe kaldırın.
G1 X55 Y40 F9000	Petri kabı aralığının dışındaki bir koordinata (55, 40) geçin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
LB et suyu tozu	Sigma-Aldrich	L3022
Yörünge sallayıcısı	VWR	89032-092	Model 3500
Petri kabı	VWR	25384-326	150 x 15 mm
Rhamnose	Sigma-Aldrich	83650
Silikon boru	VWR	DENE 3100103/25
Şırınga pompası	ProSense B.V.	NE-300
Sodyum alginat	Sigma-Aldrich	W201502
Sodyum sitrat monobazi	Sigma-Aldrich	71498
Sodyum hidrooksit	VWR	28244.295